青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆与分析

黄笑梅，金建峰，张　雪，朱思眉，朱柯柯，赵罗鹏，蒋　明，*

(1.台州学院 生命科学学院，浙江 椒江 318000；2.浙江大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310058)



青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆与分析

黄笑梅1，金建峰2，张雪1，朱思眉1，朱柯柯1，赵罗鹏1，蒋明1，*

(1.台州学院 生命科学学院，浙江 椒江 318000；2.浙江大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310058)

根据已知序列设计PCR引物，从青花菜中克隆1个NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)抗病基因BoCNL1；在生物信息学分析的基础上，利用RT-PCR研究该基因在不同器官中的表达模式。测序结果表明，BoCNL1基因的编码区全长为2 550 bp，编码849个氨基酸；编码蛋白具CC(卷曲螺旋)、NBS和LRR结构域；进化分析结果表明，BoCNL1与不结球白菜的关系最近，在进化树上处于同一分支，与醉蝶花的关系最远；RT-PCR结果表明，BoCNL1在根、花茎、叶、花蕾、开放的花和嫩角果中均有表达，但表达量低。

青花菜；抗病基因；CC-NBS-LRR；基因克隆

植物在生长过程中通常会遭受真菌、细菌、线虫、昆虫和病毒等的侵袭，通过漫长的进化，植物已形成复杂的防卫机制以抵御各种生物胁迫[1]。病害是农业生产蒙受重大损失的主要生物胁迫之一，植物抗病能力取决于病原物无毒基因和寄主抗病基因产物的识别，以及随后相关防卫途径的激活，这一过程通常由抗病基因(resistance gene， R基因)控制[2]。R基因在植物中以基因家族的形式存在，根据编码蛋白的特征，可分为NBS-LRR(nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat， 核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)、eLRR-TM(extracellular leucine-rich repeat plus transmembrane receptor， 胞外富含亮氨酸重复跨膜受体)、eLRR-TM-pkinase(extracellular leucine-rich repeat transmembrane protein kinase， 胞外富亮氨酸重复跨膜蛋白激酶)和STK(serine-threorine kinase， 丝氨酸-苏氨酸激酶)等类型[3]。

NBS-LRR在R基因中所占的比例最大，编码蛋白的NBS结构域负责ATP的水解及信号的释放，LRR则充当蛋白质相互作用的平台和蛋白活化的元件[4]。NBS-LRR参与多种病原菌的防御，在抗病信号转导和防卫反应激活过程中起着重要作用[5]。目前已从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、森林草莓(Fragariavesca)、亚麻(Linumusitatissimum)、水稻(Oryzasativa)、苹果(Malus×domestica)和番茄(Solanumlycopersicum)等植物中克隆或鉴定到大量NBS-LRR基因[6-12]。将八棱海棠(Malus×robusta)的CC-NBS-LRR基因导入苹果，后者抗火疫病的能力显著增加[13]；水稻Pi64基因编码一个新的CC-NBS-LRR蛋白，该基因与水稻叶瘟和穗瘟病抗性相关[14]。青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)是一种深受人们喜爱的保健蔬菜，在生产过程中，受多种病菌的危害，造成产量和品质下降，开展抗病分子育种有着重要的意义，而有关NBS-LRR基因的克隆未见报道。本研究从青花菜中克隆一个NBS-LRR基因的基础上，进行了序列比对和表达分析，为该基因的功能鉴定和分子育种利用奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

青花菜材料Bo0112由实验室栽植，该材料生育期为75 d左右，花球紧实，花蕾深绿色，具较强的霜霉病和灰霉病抗性。于花期采集根、叶、花茎、花蕾、开放的花和嫩角果，置于-80 ℃冰箱备用。从NCBI下载7条十字花科植物的同源序列用于比对，它们分别来自不结球白菜(B.rapa)(登录号: XP_009147850.1)、大白菜(B.rapasubsp.pekinensis)(ACP30592.1)、甘蓝型油菜(B.napus)(CDY22783.1)、高山南芥(Arabisalpina)(KFK34203.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)(AED95001.1)、亚麻荠(Camelinasativa)(XP_010456005.1)和醉蝶花(Tarenayahassleriana)(XP_010554983.1)

1.2RNA的提取和cDNA合成

RNA提取用TRIzol法；cDNA的合成采用TaKaRa公司的试剂盒，第一链和第二链的合成根据其提供的说明书进行。

1.3BoCNL1基因的克隆

根据NCBI数据库中的大白菜(登录号：FJ842840.1)和不结球白菜(B.rapa)(XM_009149572.1)的NBS-LRR基因序列设计PCR引物，分别为CNL1：5′-ATGGGAGGCTGTGTATCACTAGA-3′和CNL2：5′-TTACTCCTGTTCGTGTCTCTGAAAC-3′。反应体系中含1×phusion HF缓冲液，phusion DNA聚合酶0.5 μL(NEB， USA)，0.25 μmol·L-1的dNTPs(生工生物工程(上海)股份有限公司)，各0.25 μmol·L-1上、下游引物，60 ng叶片cDNA模板，最后加无菌ddH2O至50 μL。PCR程序为：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，57.5 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，割取含目的条带的胶块，利用碧云天生物技术研究所的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，操作根据其提供的说明书进行。采用生工生物工程(上海)股份有限公司的平端DNA片段添dA试剂盒，根据其提供的操作手册进行回收产物的平末端加A反应。取3 μL加A产物与pGEM-T easy载体(Promega， USA)连接，于42 ℃通过热激法将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，取4个阳性克隆用于测序。

1.4生物信息学分析

等电点和分子量利用在线工具http://web.expasy.org/compute_pi预测；序列比对用ClustalX 1.83软件；MEGA 3.1用于系统发育树的构建，建树方法为邻接法(neighbor joining method)，自举检测次数为1 000。

1.5表达分析

根据测序结果，设计RT-PCR引物，分别为CNL3：5′-AGTTCGTGCGCATCTATTGATG-3′和CNL4：5′-TCGATAATCCAAAGGTGTTGAACACA-3′，预期PCR产物大小约为700 bp。反应体系中含1×PCR buffer，0.5 U的TaqDNA聚合酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，0.3 μmol·L-1的dNTPs(生工生物工程(上海)股份有限公司)，各0.2 μmol·L-1的CNL4和CNL5引物，60 ng根、叶、花茎、花蕾、开放的花或嫩角果cDNA，最后加无菌ddH2O至20 μL。PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56.5 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35个循环；最后于72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳、拍照，RT-PCR实验重复3次。以肌动蛋白基因(登录号: AF044573.1)为内标，引物分别为5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和5′-GATCCTTACCG-AGGGAGGTT-3′，PCR程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55.6 ℃退火45s，72 ℃延伸90 s，共33个循环。

2　结果与分析

2.1BoCNL1基因及其编码蛋白的特征

以CNL1/CNL2为引物对，从青花菜叶片cDNA中扩增到目的条带。测序结果表明，BoCNL1基因的编码区全长为2 550 bp，分别以ATG与TAA为起始和终止密码子，GC值为39.73%。BoCNL1编码849个氨基酸，等电点为7.20，分子量大小为96.5 kD。序列分析结果表明，BoCNL1在+26～+63位具一个CC(coiled coil， 螺旋卷曲)结构域；在+158～+438处具一个NBS结构域，另有一个LRR结构域位于+534～+594处(图1)。

2.2BoCNL1的进化分析

为明确BoCNL1的进化地位，从NCBI数据库中下载了7条十字花科植物的同源序列，并利用MEGA软件构建系统发育树(图2)。结果表明，8个CNL序列之间的遗传距离为0.199～0.731，甘蓝型油菜与醉蝶花的遗传距离最大，拟南芥和醉蝶花次之，为0.720，青花菜与不结球白菜之间遗传距离最小。它们在系统发育树上可分为3组，同为芸薹属的青花菜、大白菜、不结球白菜和甘蓝型油菜聚为一组(Ⅰ)；拟南芥、高山南芥和亚麻荠聚为一组(Ⅱ)；而醉蝶花单独处于一个分支(Ⅲ)。

2.3BoCNL1基因的表达分析

为研究BoCNL1在不同器官中的表达模式，分别以等量的根、叶、花茎、花蕾、开放的花或嫩角果cDNA为模板进行PCR扩增。RT-PCR结果表明，BoCNL1在各个部位均有表达，但表达量均处于较低的水平(图3)。

3　讨论

植物抗病基因以超家族的形式存在，大约有数百甚至数千个分布于基因组中，其中以NBS-LRR类型的R基因最为丰富，它们以基因簇的形式分布在染色体上[15]。在拟南芥(哥伦比亚生态型)中有207个R基因，其中149个为NBS-LRR基因[6]；从亚麻基因组鉴定得到147个NBS-LRR，其中CC-NBS-LRR类型49个，TIR-NBS-LRR类型98个[9]；番茄有252个NBS-LRR，分布于12条染色体上[12]；苹果和大豆(Glycinemax)中的NBS-LRR基因数量十分庞大，分别有505和319个[16-17]。最近，Zhang等[18]分别从琴叶拟南芥(A.lyrata)、不结球白菜(B.rapa)、荠菜(Capsellarubella)和盐芥(Thellungiellasalsuginea)基因组中鉴定出198，204，127和88个NBS-LRR基因。本研究从青花菜中克隆到一个NBS-LRR基因，该基因的编码区全长为2 550 bp，编码849个氨基酸。

根据编码蛋白N端的结构特征，NBS-LRR可分为TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)两种类型，TIR为果蝇Toll及哺乳动物白细胞介素1受体(DrosophilaToll and mammalian interleukin-1 receptors)的缩写，CC则为卷曲螺旋(coiled coil)的简称[19]。TNL和CNL蛋白在序列和信号传导途径上存在显著差异，但它们均参与病原菌的识别，在监控效应子(effector)诱导蛋白状态方面起着重要作用[20-21]。本研究中，BoCNL1的N端具一个CC结构域，随后为NBS和LRR结构域，它是一个典型的CC-NBS-LRR蛋白。

下划线部分为螺旋卷曲结构域；阴影部分为NBS结构域；方框部分为LRR结构域。图1　BoCNL1基因及其编码蛋白序列Fig.1　Gene sequence of BoCNL1 and its deduced protein sequence

图2　BoCNL1及其同源序列的系统发生树Fig.2　Phylogenetic tree of BoCNL1 and its homologous sequences

1～6: 根、花茎、叶、花蕾、开放花和嫩角果； Ⅰ: BoCNL1 在不同器官中的表达; Ⅱ: 肌动蛋白内标。图3　BoCNL1基因的表达分析Fig.3　Expression analysis of BoCNL1

大部分NBS-LRR基因在未感染的健康植株中组成型表达，但表达量较低，仅少部分基因的表达具有组织特异性[21]。在特定病原菌的侵染下，NBS-LRR基因的表达上调，并诱导抗病相关基因的表达[22]。向日葵(Helianthusannuus)自交系QIR8 CC-NBS-LRR基因的表达受霜霉菌(Plasmoparahalstedii)诱导，并激发了一系列信号转导相关基因的表达[23]。本研究中，BoCNL1在青花菜的根、花茎、叶、花蕾、开放花和嫩角果中均有表达，具有组成性表达的特点，但表达量较低。本课题组将对该基因开展进一步研究，以明确BoCNL1在不同病原菌侵染下的表达模式，解析其在抗病反应中的生物学功能。

[1]DANGL J L， JONES J D. Plant pathogens and integrated defense responses to infection[J].Nature， 2001， 411(6839): 826-833.

[2]XIAO S， ELLWOOD S， CALIS O， et al. Broad-spectrum mildew resistance inArabidopsisthalianamediated by RPW8[J].Science， 2001， 291(5501): 118-120.

[3]王友红， 张鹏飞， 陈建群. 植物抗病基因及其作用机理[J]. 植物学通报， 2005， 22(1): 92-99.

[4]李峰， 张颖， 樊秀彩， 等. 植物NBS-LRR类抗病基因的研究进展[J]. 分子植物育种(网络版)，2011， 9: 1784-1790.

[6]MEYERS B C， KOZIK A， GRIEGO A， et al. Genome-wide analysis of NBS-LRR-encoding genes inArabidopsis[J].PlantCell， 2003， 15(4): 809-834.

[7]阙友雄， 许莉萍， 林剑伟， 等. 甘蔗NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定[J]. 作物学报， 2009， 35(4): 631-639.

[8]LI J， ZHANG Q Y， GAO Z H， et al. Genome-wide identification and comparative expression analysis of NBS-LRR-encoding genes uponColletotrichumgloeosporioidesinfection in two ecotypes ofFragariavesca[J].Gene， 2013， 527(1): 215-227.

[9]KALE S M， PARDESHI V C， BARVKAR V T， et al. Genome-wide identification and characterization of nucleotide binding site leucine-rich repeat genes in linseed reveal distinct patterns of gene structure[J].Genome， 2013， 56(2): 91-99.

[10]王世全， 张德春， 李平， 等. 水稻中一个NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析[J]. 遗传学报， 2005， 32(7): 704-711.

[11]宋霄， 柏素花， 戴洪义. 苹果NBS-LRR1基因的鉴定与表达分析[J]. 园艺学报， 2013， 40(7): 1233-1243.

[12]刘云飞， 万红建， 韦艳萍， 等. 番茄NBS-LRR抗病基因家族全基因组分析[J]. 核农学报， 2014， 28(5): 790-799.

[13]BROGGINI G A， WÖHNER T， FAHRENTRAPP J， et al. Engineering fire blight resistance into the apple cultivar ‘Gala’ using the FB_MR5 CC-NBS-LRR resistance gene ofMalus×robusta5[J].PlantBiotechnologyJournal， 2014， 12(6): 728-733.

[14]MA J， LEI C， XU X， et al. Pi64， Encoding a novel CC-NBS-LRR protein， confers resistance to leaf and neck blast in rice[J].MolecularPlant-MicrobeInteractions， 2015， 28(5): 558-568.

[15]YOUNG N D. The genetic architecture of resistance[J].CurrentOpinioninPlantBiology， 2000， 3: 285-290.

[16]KANG Y J， KIM K H， SHIM S， et al. Genome-wide mapping of NBS-LRR genes and their association with disease resistance in soybean[J].BMCPlantBiology， 2012， 12: 139.

[17]PERAZZOLLI M， MALACARNE G， BALDO A， et al. Characterization of resistance gene analogues (RGAs) in apple (Malus×domesticaBorkh.) and their evolutionary history of the Rosaceae family[J].PLoSOne， 2014， 9(2): e83844.

[18]ZHANG Y M， SHAO Z Q， WANG Q， et al. Uncovering the dynamic evolution of nucleotide-binding site-leucine-rich repeat (NBS-LRR) genes in Brassicaceae[J].JournalofIntegrativePlantBiology， 2015， doi: 10.1111/jipb.12365.

[19]李春来， 张怀渝. 植物抗病基因同源序列(RGA)研究进展[J]. 分子植物育种， 2004， 2(6): 853-860.

[20]PAN Q， WENDEL J， FLUHR R. Divergent evolution of plant NBS-LRR resistance gene homologues in dicot and cereal genomes[J].JournalofMolecularEvolution， 2000， 50(3): 203-213.

[21]MCHALE L， TAN X， KOEHL P， et al. Plant NBS-LRR proteins: adaptable guards[J].GenomeBiology， 2006， 7(4): 212.

[22]NAVARRO L， ZIPFEL C， ROWLAND O， et al. The transcriptional innate immune response to flg22. Interplay and overlap with Avr gene-dependent defense response and bacterial pathogenesis[J].PlantPhysiology， 2004， 135(2): 1113-1128.

[23]RADWAN O， MOUZEYAR S， NICOLAS P， et al. Induction of a sunflower CC-NBS-LRR resistance gene analogue during incompatible interaction withPlasmoporahalstedii[J].JournalofExperimentalBotany， 2015， 56(412): 567-575.

(责任编辑张韵)

Cloning and characterization of a CC-NBS-LRR disease resistance gene of BoCNL1 from Brassica oleracea var. italica

HUANG Xiao-mei1， JIN Jian-feng2， ZHANG Xue1， ZHU Si-mei1， ZHU Ke-ke1， ZHAO Luo-peng1， JIANG Ming1,*

(1.CollegeofLifeSciences，TaizhouUniversity，Jiaojiang318000，China; 2.CollegeofLifeSciences，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China)

Primer pairs were designed according to known sequences， and a nucleotide-binding site plus leucine-rich repeat (NBS-LRR) disease resistance gene， designatedBoCNL1， was isolated from broccoli (Brassicaoleraceavar.italic). Bioinformatic analysis were performed， and RT-PCR was used to reveal expression patterns ofBoCNL1 in different organs. Results indicated that the complete coding sequence ofBoCNL1 was 2 550 bp in length， encoding 849 amino acids; and the deduced protein sequence contained coiled coil(CC)， NBS， and LRR domains. Phylogenetic analysis results showedBoCNL1 was grouped with the homologous gene inB.rapa， indicating their closest relationship， and the longest genetic distance was observed betweenB.oleraceavar.italicaandTarenayahassleriana. RT-PCR results demonstrated thatBoCNL1 expressed with low levels of transcripts in roots， flower stalks， leaves， flower buds， flowers， as well as young siliques.

Brassicaoleraceavar.italica; disease resistance gene; CC-NBS-LRR; gene cloning

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.13

2015-07-04

浙江省自然科学基金项目(LY13C150003)；浙江省大学生科技创新活动计划(新苗人才计划)(2014R428011)；浙江省本科院校中青年学科带头人学术攀登项目(pd2013420)

黄笑梅(1993—)，女，浙江义乌人，本科生，从事植物分子生物学研究。E-mail: 369393248@qq.com

，蒋明，E-mail：jiangming@tzc.edu.cn

S635.3；Q78

A

1004-1524(2016)02-0259-05

黄笑梅，金建峰，张雪，等. 青花菜CC-NBS-LRR抗病基因BoCNL1的克隆与分析[J].浙江农业学报，2016，28(2)： 259-263.