产雌马酚梭菌C1对小鸡沙门氏菌攻毒保护效果

2016-10-31尹业师朱立颖

浙江农业学报 2016年2期

尹业师，方　丹，朱立颖，刘　伟，吴　健，王　欣，*

(1. 浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所/农产品质量安全国家重点实验室培育基地，浙江杭州 310021；2. 华中农业大学动物医学院，湖北武汉 430070)

尹业师1，方丹2，朱立颖1，刘伟1，吴健2，王欣1，*

部分梭菌对机体的免疫系统具有明显的调节作用，可开发成新型益生菌。由于鸡盲肠内容物中梭菌含量较高，从小鸡肓肠内容物中分离培养功能性梭状芽孢杆菌，并在小鸡中初步研究其对沙门氏菌攻毒的保护效果。该研究首先采用梭菌选择性培养基，从小鸡肓肠内容物中分离获得了一株可以将大豆素转化为雌马酚的革兰氏阳性纤维状梭菌C1，以四环素为对照，研究梭菌C1对小鸡沙门氏菌攻毒的保护作用。结果表明，梭菌C1组和四环素组均具有降低肓肠内容物中沙门氏菌活菌数和促进小鸡生长的功能，推测梭菌C1具有开发为四环素替代品的潜能。虽然较高浓度的S-雌马酚(5 mg·mL-1)在体外对沙门氏菌有一定的抑制作用，梭菌C1也具有将大豆素转化为雌马酚的能力，但梭菌C1在体外对沙门氏菌的抑制作用并不明显，其益生机制还有待进一步研究。

梭菌；雌马酚；小鸡；沙门氏菌

随着“超级细菌”的报道与流行，细菌的抗菌素耐药越来越受到关注。在细菌抗菌素耐药日趋严峻的形势下，很多学者把耐药菌的产生归因于畜禽抗菌素的滥用[1-2]。欧盟很多国家已经禁止使用抗菌素作为动物促生长剂，而抗菌素替代品——益生菌的应用前景广阔。目前，商用的益生菌主要是乳酸菌和双歧杆菌，但家禽消化道中的优势菌群主要为拟杆菌和梭菌[3-4]，所以寻求新的益生菌迫在眉睫。虽然有些拟杆菌和梭菌是条件性致病菌，但最近研究表明，很多拟杆菌和梭菌均有助于宿主对营养物质的消化利用及调控宿主免疫系统的发育成熟[5-8]。所以，开发新的拟杆菌和梭菌在益生菌定殖和功能发挥方面具有一定优势。

梭状芽孢杆菌是硬壁菌门中一类革兰氏阳性杆状细菌，具有产生内孢子和在恶劣条件下存活的生态优势。尽管有些梭菌由于能产生毒素类物质而具有致病性，但大部分梭菌与宿主之间维持着共生关系。ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌占肠道总菌的10%～40%[4]，能够产生各种具有生物活性的酶，以帮助宿主降解利用宿主自身无法消化的多糖和寡糖类物质[5]，其降解产物包括乙酸、丙酸和丁酸等重要的能量来源物质。最新研究发现，ⅩⅣa簇和Ⅳ簇梭菌具有调节宿主免疫系统发育和成熟的功能[6]，由梭菌属ⅩⅣa簇和Ⅳ簇组成的46株梭菌的复合物，具有促进肠道上皮T淋巴细胞和免疫球蛋白A(IgA)分泌细胞分化增殖的能力[7]。因此，从鸡肠道内容物分离培养梭状芽孢杆菌，研究其生理功能显得尤为重要。

本研究采用梭菌选择培养基，从鸡盲肠内容物中分离获得了一株可以将大豆素转化为雌马酚的梭状芽孢杆菌C1。沙门氏菌攻毒保护试验表明，梭菌C1具有抑制沙门氏菌定殖和促进小鸡生长的功能。

1　材料与方法

1.1梭菌C1的分离鉴定

15日龄AA肉鸡购自浙江大学海宁种鸡场。小鸡用乙醚麻醉后，直接扭颈处死，腹腔解剖后将肓肠转移到37 ℃厌氧工作站(英国Electrotek公司)。称取小鸡肓肠内容物0.2 g，加入2 mL灭菌PBS，混匀后配制成10%的悬液。再用PBS将10%的悬液按10-2，10-4，10-6和10-8进行梯度稀释，然后取各个稀释度菌液100 μL涂布在梭菌选择培养基平板上(青岛海博生物技术有限公司)。平板在37 ℃厌氧工作站内倒置培养3 d后，挑取乳白色菌落至液体梭菌培养基中(青岛海博生物技术有限公司)，静置培养5 d后将菌液离心沉淀(5 000g离心 5 min)，然后用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒(Qiagen)进行细菌基因组DNA提取。采用细菌16S rDNA全长通用引物27F和1492R进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，具体操作步骤参照TaKaRa ExTaq说明书进行。采用革兰氏染色液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)和生物显微镜CX51(OLYMPUS)对梭菌C1进行形态学观察。

1.2梭菌C1产雌马酚能力检测

将121 ℃高压灭菌20 min的BHI培养基分装到试管中，每管5 mL，然后加入5 μL浓度为5 mg·mL-1的大豆素贮存液，混匀后接种活化好的梭菌C1 50 μL，在37 ℃厌氧工作站中静置培养96 h后收集发酵液。发酵液5 000g离心 5 min，将900 μL上清液用等量的乙酸乙酯萃取抽提3次，然后将萃取的上清液混合，45 ℃冷冻离心浓缩成粉末，加入200 μL甲醇溶解，经0.22 μm聚偏氟乙稀微孔滤膜过滤后，参照王宇等[9]的方法，使用HPLC对溶液中的雌马酚浓度进行检测。

1.3梭菌C1菌悬液和发酵液上清对沙门氏菌的体外抑制试验

配置1.2%的LB琼脂平板，用一次性细菌接种环将过夜培养的沙门氏菌划线接种到冷却凝固的LB平板上，然后将直径6 mm的无菌滤纸片轻轻放入平板中，将5 μL梭菌C1菌悬液、梭菌C1发酵液上清、四环素水溶液(2 mg·mL-1)及不同浓度的S-雌马酚溶液(0.2，1.0和5.0 mg·mL-1)和相应的有机溶剂甲醇分别点到滤纸片上。平板在37 ℃细菌培养箱内倒置培养14 h后观察抑菌圈大小。

1.4梭菌C1对小鸡沙门氏菌攻毒保护试验

1.4.1试验动物

刚出壳清洁级Ross308肉鸡，购自浙江大学海宁种鸡场。

1.4.2试验日粮

所喂饲料参照文献[10]的配方配制。

1.4.3试验用菌株

梭菌C1为本研究从小鸡肓肠内容物中分离获得；沙门氏菌CVCC519购自中国兽医药品监察所。菌株活化后保存在4 ℃冰箱备用。

1.4.4饲养试验设计

将刚出壳的小鸡平均分成3组，分别标记为梭菌C1组、四环素组和对照组。每组小鸡初始体质量平均为(44±1.1)g。每组设2个平行，每个平行各10只小鸡。梭菌C1组小鸡每天每只经口腔用灌胃针灌喂0.2 mL活化好的梭菌C1(2×107cfu·mL-1)，连续灌喂5 d；四环素组按0.1 g·mL-1的量将四环素添加在饮水中，小鸡自由饮用，每天更换1次；对照组不进行任何干预。6日龄时对所有小鸡进行沙门氏菌攻毒，每只小鸡灌喂0.2 mL活化好的沙门氏菌菌液(2×107cfu·mL-1)，连续灌喂2 d。攻毒后，梭菌C1组再用梭菌C1菌液灌喂2 d，四环素组再在饮水中添加0.1 g·mL-1四环素2 d，此后不再进行干预。所有试验组小鸡均自由采食饮水。

1.4.5小鸡平均体质量检测

分别在沙门氏菌攻毒后第2，9，16和23天记录每只小鸡体质量，并计算平均体质量。

1.4.6沙门氏菌活菌数检测

分别在沙门氏菌攻毒后第2，9，16和23天随机选取每个试验组4只小鸡，每个平行各2只，解剖后取其盲肠内容物。用电子天平称取0.1 g盲肠内容物，迅速加入0.9 mL PBS充分混匀。将稀释好的鸡盲肠内容物再用PBS依次进行梯度稀释，然后分别取10-4，10-5，10-6，10-7四个稀释度的菌液各100 μL涂布到可用于沙门氏菌鉴别的选择性琼脂平板DHL上，37 ℃培养过夜后进行菌落记数。

1.5数据统计

试验数据采用SPSS 20.0进行平均值与标准误差分析及统计学检验。

2　结果与分析

2.1梭菌C1的分子生物学鉴定与形态学观察

对梭菌C1的16S rRNA序列PCR产物进行Sanger测序，然后对所得序列在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST比对分析，结果显示，梭菌C1与从人粪便样品中分离到的一株产雌马酚梭菌TM-40相似度最高，其16S rRNA基因的DNA序列相似性达到100%。形态学观察表明，梭菌C1是一种具有分节的纤维状革兰氏阳性菌(图1)。综上所述，推测梭菌C1可能是一株新的具有产生雌马酚能力的梭菌。

图1　梭菌C1革兰氏染色结果Fig.1　Gram stain results of the Clostridium C1

2.2梭菌C1产S-雌马酚能力检测

由于梭菌C1与雌马酚产生菌TM40同源性最高，本研究对梭菌C1是否也具有雌马酚产生能力进行了检测。从图2的HPLC检测结果可以看出，与S-雌马酚标准品相比，梭菌C1发酵液在约9.5 min时也能检测到相对应的光谱吸收峰，说明梭菌C1在体外具有将大豆素转化为S-雌马酚的能力。

2.3梭菌C1和S-雌马酚对沙门氏菌的体外抑制试验

平板抑菌圈试验结果显示，无论有氧还是厌氧条件下，四环素对沙门氏菌均出现明显的抑菌圈，而梭菌C1菌悬液及其上清液周围没有出现明显的抑菌圈(图3)，说明梭菌C1在体外对沙门氏菌的抑制效果不明显。从图3可以看出，S-雌马酚溶液在体外对沙门氏菌的生长有一定的抑制作用，但其抑制作用具有浓度依赖性，只有5 mg·mL-1S-雌马酚溶液周围出现了较明显的抑菌圈。

A： S-雌马酚标准品； B：梭菌C1发酵液样品。图2　HPLC检测梭菌C1发酵液中的雌马酚含量Fig.2　Equol concentration in Clostridium C1 fermentation broth using HPLC

1：梭菌C1菌悬液； 2：梭菌C1发酵液上清； 3：四环素； 4：甲醇； 5： 0.2 mg·mL-1 S-雌马酚； 6： 1 mg·ml-1 S-雌马酚； 7： 5 mg·mL-1 S-雌马酚。图3　不同处理对沙门氏菌的体外抑制效果Fig.3　Inhibition effects on the growth of Salmonella by different treatments

2.4梭菌C1对小鸡的促生长作用

如图4所示，四环素组小鸡生长速度最快，在沙门氏菌感染后第9天小鸡平均体质量就明显高于对照组(P<0.01)，一直到试验结束即沙门氏菌感染后第23天，四环素组小鸡平均体质量仍明显高于对照组(P<0.05)。梭菌C1组在沙门氏菌感染后第2天生长速度就比对照组快，尤其是在沙门氏菌感染后第16和23天，其平均体质量显著高于对照组(P<0.05)。虽然在沙门氏菌感染后第9天，四环素平均体质量显著高于梭菌C1组，但到感染后第16和23天，梭菌C1组与四环素组之间没有显著差异(P>0.05)，说明梭菌C1与四环素对小鸡具有类似的促生长功能。

沙门氏菌感染后，相同时间不同处理间无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4　小鸡平均体质量Fig.4　Average weight of chicken

2.5梭菌C1对小鸡肓肠内容物中沙门氏菌活菌数的影响

如图5所示，与对照组相比，四环素组沙门氏菌活菌数持续下降，在沙门氏菌感染后第2天，四环素组小鸡肓肠内容物中沙门氏菌活菌数显著低于对照组(P<0.05)，到感染后第23天，已经检测不到沙门氏菌活菌的存在。梭菌C1组的沙门氏菌活菌数在感染后第2天即少于对照组，从感染后第9天直到试验结束即感染后第23天，梭菌C1组的沙门氏菌活菌数均显著低于对照组。但在试验中，只在感染后第2和9天，梭菌C1组与四环素组间沙门氏菌活菌数无显著差异(P> 0.05)；在感染后第16和23天，梭菌C1组沙门氏菌活菌数极显著高于四环素组(P<0.01)，说明梭菌C1处理只在短期内具有与四环素类似的抵御沙门氏菌繁衍和定殖的效果。

沙门氏菌感染后，相同时间不同处理间无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5　小鸡盲肠内容物沙门氏菌活菌计数Fig.5　Numbers of live Salmonella in chicken cecal contents

3　结论与讨论

沙门氏菌感染是一种动物源性人畜共患病，严重影响公共健康、食品安全和动物生产[11]。迄今为止，疫苗和抗菌素对沙门氏菌的防治效果还不是很理想[12-13]。竟争性排斥益生菌曾被认为是一种防治沙门氏菌感染的替代疗法[14]。目前，很多学者正在试图从环境样品中分离对沙门氏菌具有防治作用的益生菌。Yang等[15]对小猪和小鸡肠道来源乳酸产生菌防治沙门氏菌的效果和防治机制进行了初步研究，发现乳酸产生菌虽然在体外对沙门氏菌生长具有抑制作用，但在小鸡肠道内却不能减少沙门氏菌活菌数，本研究结果与此存在一定的差异。尽管益生菌可能通过多种途径抑制沙门氏菌在胃肠道内的定殖和繁衍，但产生抗菌类物质仍是其最直接和最主要的途径[16]。Yang等[15]推测乳酸产生菌在体内不能减少肠道沙门氏菌定殖的原因可能是乳酸产生菌在肠道环境中没有分泌抗菌类物质。本研究中，虽然体外试验没有观察到梭菌C1对沙门氏菌有明显的抑制效果，但动物试验却表明，梭菌C1组小鸡肓肠内容物中沙门氏菌活菌数明显减少。这可能是由于梭菌C1在体内分泌或积累了更多的抗菌类物质如S-雌马酚，或者梭菌C1具有刺激宿主免疫的功能，从而达到在体内间接抑制沙门氏菌的功效。虽然已有大量学者对益生菌的益生效果和作用机制进行了研究，但各自研究结果间存在着一定的差异，这可能是不同益生菌的防治效果和作用机制有所不同所致。Yang等[15]研究发现，乳酸产生菌防治沙门氏菌的益生机制可能是减少脾脏和肝脏沙门氏菌的数量及降低沙门氏菌毒力基因的表达。Eloe-Fadrosh等[17]研究报道，鼠李糖乳杆菌LGG的益生机制可能是通过促进其他肠道菌群(包括拟杆菌属、双歧杆菌属等)的生长，从而促进免疫系统的健康发育。

综上所述，不同益生菌防治沙门氏菌感染的生理活性表现形式和作用机制存在差异。本研究从小鸡肓肠内容物中分离获得了一株雌马酚产生梭菌C1，虽然体外抑制试验结果表明，梭菌C1或其发酵液上清对沙门氏菌的生长并没有明显的抑制作用；但动物试验结果表明，梭菌C1不仅可以减少小鸡体内沙门氏菌活菌数，还能促进小鸡生长，其作用机制有待进一步研究。

大豆异黄酮具有促进畜禽生长和乳腺发育、提高动物繁殖力和泌乳性能、增强机体免疫力等功能，且食品中大豆异黄酮等天然植物雌激素对人类健康有益。因此，大豆异黄酮作为一种新型饲料添加剂具有较大的开发价值和广阔的应用前景。临床上大豆异黄酮的疗效主要归功于其代谢产物S-雌马酚[18]。S-雌马酚是一种植物雌激素，是大豆异黄酮在哺乳动物肠道中经微生物转化后的代谢产物，其生物学活性包括雌激素样活性[19]、抗氧化活性[20]等均较其前体大豆素强。但机体将大豆素代谢转化为雌马酚的能力具有个体差异，亚洲人群中只有30%～50%的人具有将大豆异黄酮转化为雌马酚的能力，在大白母猪粪便中雌马酚的个体差异系数也可以达到60%以上[21]。所以在以豆制品为主要饲料来源的养殖业中，以雌马酚产生菌作为益生菌将能更好地发挥大豆异黄酮的生物功能。

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(责任编辑侯春晓)

Protective effect of an equol-producing Clostridium C1 against Salmonella infection in chicken

YIN Ye-shi1， FANG Dan2， ZHU Li-ying1， LIU Wei1， WU Jian2， WANG Xin1，*

(1.InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences/StateKeyLaboratoryofBreedingBaseforAgriculturalProductQualitySecurity，Hangzhou310021，China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China)

SomeClostidiumcould regulate the development of the host immune system. Hence， theseClostidiumstrains had the potential to be used as probiotics. Since the population ofClostridiumin chicken cecal contents was relative high， the aims of this study were to isolate functionalClostidiumstrains from chicken cecal contents and subsequently study their protective effect againstSalmonellainfection. In this study， a Gram-positive filamentousClostridiumsp C1 which could transfer daidzein to equol， was isolated from chicken cecal contents and then the animal experiments were conducted to study the protective effect ofClostridiumsp C1 onSalmonellainfection. As the tetracycline treated group did， theClostridiumsp C1 also had effect on decreasing the number ofSalmonellain cecal contents and promoting the growth of chicken. Thus， theClostridiumsp C1 had the potential to be used as a tetracycline substitute. Although， the high concentration of S-equol (5 mg·mL-1) had the function on inhibiting the growth ofSalmonellainvitroand theClostridiumsp C1 had the function of transfering daidzein to S-equol， the inhibition effects ofClostridiumsp C1 onSamonellagrowth was not observedinvitro. The probiotic mechanism ofClostridiumsp C1 need to be further studied.

Clostridium; equol; chicken;Salmonella

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.02.09

2015-07-06

国家自然基金(3100097)；“十二五”农村领域国家科技计划(2013BAD10B02-03)

尹业师(1982—)，男，湖南邵阳人，博士，副研究员，主要从事肠道微生态与微生物资源研究。E-mail: yinyeshi@126.com

，王欣，xxww101@sina.com

S831.7

1004-1524(2016)02-0234-06

尹业师，方丹，朱立颖，等. 产雌马酚梭菌C1对小鸡沙门氏菌攻毒保护效果[J]. 浙江农业学报， 2016， 28(2): 234-239.