甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸两亲性嵌段共聚物的合成与表征

陈 洋， 肖 艳（华东理工大学材料科学与工程学院，上海200237）

甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸两亲性嵌段共聚物的合成与表征

陈 洋， 肖 艳
（华东理工大学材料科学与工程学院，上海200237）

首先以聚乙二醇单甲醚（mPEG-OH）为单体，采用经典的盖布瑞尔伯胺合成法合成了端氨基聚乙二醇单甲醚（mPEG-NH2）；然后以mPEG-NH2为引发剂，S-苄基L-半胱氨酸N-羧酸内酸酐（BCys-NCA）为原料，通过N-羧酸内酸酐（NCA）开环聚合反应和液氨/钠处理脱除侧链上的保护基团，合成了两亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸（mPEG-b-PCys）。采用傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱对聚合物的结构和组成进行了表征。结果表明：成功制备了侧链具有还原性巯基的两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PCys，并且其聚合度可控性良好。

聚乙二醇单甲醚；巯基；两亲性；嵌段共聚物

生物医用高分子材料作为高分子材料领域中的一大重要分支，因其在生物体诊断、治疗，以及替换、修复或再生损伤组织和器官等方面的重要作用，得到了国内外众多研究机构的广泛关注［1］。与传统生物医用高分子材料相比，聚肽材料因其良好的生物相容性、生物可降解性以及独特的二级构象，在组织工程、细胞信号调节、生物诊断与治疗、药物运输、药物缓释以及生物化学反应催化等领域有着越来越广泛的应用［2-5］。但是大多数的聚肽材料由于严重的分子内及分子间氢键作用，导致其在水中的溶解性差［6］。而聚乙二醇作为一种常用的生物医用高分子材料，具有优良的水溶性以及生物相容性，它无毒、无刺激性，与很多有机溶剂可以很好地相溶，因此被越来越多地用于改善疏水性聚合物的水溶性，制备具有自组装行为的两亲性嵌段共聚物。

近年来，将聚乙二醇引入到聚肽材料中，制备聚肽基两亲性嵌段共聚物已经成为研究的热点：林嘉平等［7］使用端氨基聚乙二醇单甲醚（mPEG-NH2）为引发剂，引发苄基L-谷氨酸N-羧酸内酸酐（BLG-NCA）开环聚合，制备出含有亲水性聚乙二醇嵌段和疏水性聚肽嵌段的刷型聚合物，并进一步研究了该聚合物水溶液的自组装行为；陈学思等［8］使用mPEG-NH2为引发剂，引发L-苯丙氨酸N-羧酸内酸酐和L-胱氨酸N-羧酸内酸酐开环聚合，成功制备出聚乙二醇-b-聚氨基酸共聚物。随后他们将聚合物溶解在磷酸盐缓冲溶液（PBS）中制成聚合物纳米胶束，并将阿霉素（DOX）载入到胶束内核中。由于胱氨酸的存在将二硫键（S-S）引入到了纳米胶束的内核中，因此该胶束在还原剂谷胱甘肽的作用下，内核中的二硫键会断裂，进而使胶束解体，释放出其中所包载的DOX，实现了药物在还原剂刺激条件下的控制释放。Carmen Scholz等［9］采用mPEG-NH2为引发剂，引发带有保护性基团的L-谷氨酸N-羧酸内酸酐和L-半胱氨酸N-羧酸内酸酐单体开环聚合，然后经过脱保护反应制备出聚乙二醇-b-聚L-谷氨酸-b-聚L-半胱氨酸（PEG-b-PGlu-b-PCys）三嵌段共聚物。因为聚L-半胱氨酸嵌段中的巯基容易与金反应形成Au-S键，因此该聚合物在金表面修饰领域有着广阔的应用前景。

本文采用端氨基聚乙二醇单甲醚（mPEG-NH2）为引发剂，引发S-苄基L-半胱氨酸N-羧酸内酸酐（BCys-NCA）开环聚合制备出两亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚S-苄基L-半胱氨酸（mPEG-b-PBCys）。然后经过脱保护反应，脱除侧链上的保护基团（苄基），制备侧链含有活泼性巯基的两亲性嵌段共聚物甲氧基聚乙二醇-b-聚L-半胱氨酸（mPEG-b-PCys）。因为侧链巯基活性比较高，容易进行多种巯基化学反应，因此本文为后续的功能化修饰研究奠定了良好的理论基础。

1　实验部分

1.1原料及试剂

聚乙二醇单甲醚（mPEG-OH，Mw=2.0×103）、对甲苯磺酰氯、邻苯二甲酰亚胺钾：化学纯，Sigma-Aldrich试剂公司；二氯甲烷、三乙胺、碳酸钠：分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；甲苯、丙酮、无水乙醚、重水、氘代二甲基亚砜：分析纯，上海泰坦科技股份有限公司；BCys-NCA：化学纯，上海晶纯生化科技股份有限公司；钠：分析纯，内蒙古兰太实业股份有限公司。

1.2原料的预处理

（1）mPEG-OH的干燥：将mPEG-OH（30 g）溶解在30 m L甲苯中，120℃的油浴条件下使用油水分离器和球形冷凝管蒸馏除水，重复3次。然后置于80℃的油浴条件下抽真空干燥12 h，室温下自然冷却后保存待用。

（2）对甲苯磺酰氯的纯化：首先将对甲苯磺酰氯溶于一定比例的干燥过的甲苯-正己烷混合溶液中，然后将溶液置于60℃的油浴条件下加热使其充分溶解，最后将其置于-20℃的冰箱中冷却结晶，抽滤、真空干燥得到白色针状固体产物。

（3）N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（CH2Cl2）：使用氢化钙干燥48 h，蒸馏并密封保存。

1.3实验过程

1.3.1mPEG-NH2的制备 准确称量20 g（11.8 mmol）mPEG-OH和4.5 g（23.6 mmol）对甲苯磺酰氯加入到80 m L无水二氯甲烷中，然后加入28 m L三乙胺作为缚酸剂，室温下搅拌反应12 h。然后用事先配好的盐酸溶液（1 mol/L）对反应液进行洗涤，直至溶液为中性。最后用无水碳酸钠干燥12 h，减压蒸馏除去大约2/3的溶剂。抽滤，除去溶液中的固体颗粒后，将滤液用过量的无水乙醚沉降，抽滤得到中间产物甲氧基聚乙二醇-对甲苯磺酸酯（mPEG-OTs）。

称取10 g（5.9 mmol）上述反应产物、1.85 g（11.8 mmol）邻苯二甲酰亚胺钾溶解于70 m L DMF中，120℃下搅拌反应6 h后，减压蒸馏除去DMF。然后再加入120 m L无水乙醇、10 m L 80%的水合肼回流反应12 h。反应液在大量无水乙醚中沉降、抽滤得到白色固体。将此白色固体溶解于CH2Cl2中，滤出不溶物，滤液用大量无水乙醚沉降，抽滤、真空干燥得到mPEG-NH2。

1.3.2mPEG-b-PBCys的制备 称取7.11 g（30 mmol）BCys-NCA、4 g（2 mmol）mPEG-NH2，加入到150 m L DMF中，在氮气保护条件下，冰水浴中反应72 h。反应结束后，将反应液用过量的无水乙醚沉降，离心、真空干燥得到白色固体产物即为嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

1.3.3mPEG-b-PCys的制备 称取5 g mPEG-b-PBCys加入到100 m L液氨中，切取少许钠丝分批加入到反应体系中（每一小块Na加入后，反应体系会呈深蓝色，然后颜色逐渐退去，待深蓝色消失后再补加金属Na），干冰-丙酮浴条件下搅拌反应8 h。反应结束后挥发掉剩余的液氨，加入150 m L去离子水搅拌30 min，抽滤得到澄清滤液。向滤液中滴加盐酸至p H=5，然后将产物置于透析袋（截留分子量为1 000）中透析72 h。透析完成后将产物置于冷冻干燥机中干燥72 h，即可得到产物mPEG-b-PCys。

1.4测试与表征

核磁共振氢谱（1H-NMR）采用德国布鲁克公司生产的Bruker 400 MHz核磁共振波谱仪测定，以重水（D2O）、氘代二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，四甲基硅烷（TMS）作为内标。通过质子氢在谱图上的各出峰位置、峰的相对面积积分比，确定聚合物的分子结构，通过参比基准物对比计算出聚合物的聚合度、数均分子量；傅里叶变换红外光谱（FT-IR）使用美国尼高力仪器公司Nicolet 5700型傅里叶红外光谱仪测定，采用固体溴化钾（KBr）压片法制样。

2　结果与讨论

2.1合成路线

考虑到均聚L-半胱氨酸（PCys）的溶解性非常差，本文旨在将亲水性的mPEG-OH引入到聚合物主链中，制备两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。然后通过脱保护操作，将巯基上的保护基（苄基）脱除，以暴露出具有高度反应活性的巯基基团，为后续的修饰反应提供反应位点。具体的合成路线如图1所示。

图1　mPEG-NH2和mPEG-b-PCys的合成路线Fig.1 Synthetic routes for mPEG-NH2and mPEG-b-PCys copolymers

2.2 mPEG-NH2的结构表征

图2（A）为mPEG-OTs的核磁共振氢谱，聚合物中所有氢的特征峰已经在核磁共振氢谱中标出。d峰（苯环，7.23～7.76）和e峰（甲基，2.34）的出现说明末端羟基已经成功转变成了对甲苯磺酸酯基。图2（B）为mPEG-NH2的核磁共振氢谱，与图2（A）相比，聚合物在7.23～7.76（d峰）和2.34（e峰）处的吸收峰已经全部消失，表明末端的对甲苯磺酰基已经成功脱除，在1.83处出现了一个新的吸收峰，经重水交换反应验证为末端氨基上活泼氢的吸收峰。因此，可以确定本文成功制备出了mPEG-NH2。

图2　mPEG-OTs（A）和mPEG-NH2（B）的核磁共振氢谱Fig.21H-NMR spectra of mPEG-OTs（A）and mPEG-NH2（B）

2.3mPEG-b-PBCys的结构表征

图3为mPEG-b-PBCys的核磁共振氢谱。从图中可以看出产物中各个吸收峰都能找到相应的归属。其中3.23处为mPEG嵌段中末端甲基的吸收峰（a峰），7.23～7.76处为PBCys嵌段中苯环的吸收峰（g峰），3.67处为与苯环相连的亚甲基的吸收峰（f峰）。根据a峰和g峰的面积比可以算出产物的实际聚合度为21，设计聚合度为20，实际聚合度与设计聚合度有一定的差别，推测原因是mPEG-NH2的活性较低，有少量引发剂未能成功引发聚合反应，所以造成实际聚合度略高于理论聚合度。

图4为mPEG-b-PBCys的红外光谱，图中1 630 cm-1和1 517 cm-1处为PBCys嵌段中羰基和仲胺的吸收峰，1 500～2 000 cm-1处锯齿状吸收峰为侧链苄基吸收峰。综合核磁和红外结果可知，mPEG-b-PBCys被成功合成。

图3　mPEG-b-PBCys的核磁共振氢谱Fig.31H-NMR spectrum of mPEG-b-PBCys

图4　mPEG-b-PBCys的红外光谱Fig.4 FT-IR spectrum of mPEG-b-PBCys

2.4mPEG-b-PCys的结构表征

图5为mPEG-b-PCys的核磁共振氢谱。从图中可以看出：与mPEG-b-PBCys的核磁结果相比较，在7.23～7.76处的苯环的吸收峰和在3.67处与苯环相连的亚甲基的吸收峰（f峰）同时消失，其他吸收峰并没有显著变化，并且各个吸收峰都能找到相应的归属。为了进一步确定苄基脱除后是否成功暴露出了活泼的巯基，又对产物mPEG-b-PCys进行了傅里叶变换红外光谱表征（图6），与mPEG-b-PBCys的结果相比，在1 500～2 000 cm-1处的锯齿状的吸收峰全部消失，在2 550 cm-1处出现了巯基的吸收峰。综合核磁和红外结果可知，本文成功制备出了两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。

图5　mPEG-b-PCys的核磁共振氢谱Fig.51H-NMR spectrum of mPEG-b-PCys

图6　mPEG-b-PCys的红外光谱Fig.6 FT-IR spectrum of mPEG-b-PCys

3　结 论

（1）采用经典的盖布瑞尔伯胺合成法（Gabriel method），通过聚乙二醇单甲醚与对甲苯磺酰氯、邻苯二甲酰亚胺钾、水合肼反应，成功制备了大分子引发剂端氨基聚乙二醇单甲醚mPGE-NH2。

（2）以mPGE-NH2为引发剂，引发BCys-NCA单体开环聚合，制备出两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PBCys。

（3）通过脱保护反应，成功将mPEG-b-PBCys侧链上的苄基脱除，制备出两亲性嵌段共聚物mPEG-b-PCys。由于侧链上的巯基化学性质非常活泼，因此为后续反应提供了反应位点。

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Synthesis and Characterization of Poly（ethylene glycol）-b-Poly（L-cysteine）Block Copolymer

CHEN Yang， XIAO Yan
（School of Materials Science and Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

Amine-terminated mPEG（mPEG-NH2）was first synthesized by Gabriel method using mPEG-OH as the monomer.Methoxy poly（ethylene glycol）-b-poly（L-cysteine）（mPEG-b-PCys）amphiphilic block copolymers were further synthesized by ring opening copolymerization of S-benzyl L-cysteine N-carboxyanhydride（BCys-NCA）initiated with the amine terminated mPEG and followed by the removal of the protected groups using liquid NH3/Na.The structures of the polymers were characterized by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy（1H-NMR）and Fourier Transform Infrared spectroscopy （FT-IR）.Results showed that the amphiphilic block copolymers containing active thiol groups were synthesized successfully，and the degree of polymerization was controllable.

poly（ethylene glycol）；thiol group；amphiphilic；block copolymer

TQ317

A

1008-9357（2016）02-0188-005DOI： 10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.02.007

2016-05-08

陈 洋（1989-），男，山东济宁人，硕士生，主要研究方向为功能化聚肽材料的合成及其性能研究。E-mail：ychen_ecust@163.com

肖 艳，E-mail：yxiao@ecust.edu.cn