VEGF、SDF-1在糖尿病视网膜血管病变发生、发展中的作用及机制

高　静， 刘　晓， 王敏哲， 刘贯英， 杨雪松

(新疆医科大学1第五附属医院内分泌科， 乌鲁木齐　830011； 2第一附属医院心脏起搏与介入诊疗中心， 乌鲁木齐　830054)



VEGF、SDF-1在糖尿病视网膜血管病变发生、发展中的作用及机制

高静1， 刘晓2， 王敏哲1， 刘贯英1， 杨雪松1

(新疆医科大学1第五附属医院内分泌科， 乌鲁木齐830011；2第一附属医院心脏起搏与介入诊疗中心， 乌鲁木齐830054)

目的探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)、基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)在糖尿病视网膜血管病变中的作用机制。方法运用链脲佐菌素(STZ)注射及脂肪乳灌胃的方法构建糖尿病大鼠模型、糖尿病合并视网膜病变大鼠模型。随机分为对照组、糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组、糖尿病合并视网膜病变24 w组，每组30只。对各组制模大鼠给予玻璃体内注射贝伐单抗进行干预，4 w后，处死动物提取视网膜组织。观察干预前后大鼠视网膜组织病理学变化,检测视网膜组织中VEGF、SDF-1基因和蛋白的表达。结果干预前，糖尿病组大鼠视网膜镜下表现与对照组大致相似，血管未见明显异常；糖尿病合并视网膜病变12 w组大鼠视网膜镜下可见各层细胞排列不整齐，偶见毛细血管内皮细胞突出内界膜；糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜镜下可见视网膜内界膜水肿明显，各层细胞排列明显不整齐，较多血管内皮细胞突出内界膜。干预后，对照组和糖尿病组大鼠视网膜组织镜下表现与干预前均无明显差异；糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜镜下均可见视网膜内界膜水肿明显减轻，毛细血管内皮细胞突出内界膜的情况明显得到改善。干预前，对照组、糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠的视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白和基因的表达逐渐升高，4组间比较差异有统计学意义(F=8.56、7.46， P<0.05)。干预后4组大鼠的视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白和基因的表达均出现下降，以糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组下降更明显，4组间比较差异有统计学意义(F=9.06,7.26、P<0.05)。结论VEGF、SDF-1参与了糖尿病视网膜血管病变的发生，阻断VEGF的表达能明显改善视网膜血管病变，且抑制VEGF表达可以下调SDF-1表达水平。

糖尿病视网膜血管病变； 血管内皮生长因子； 基质细胞衍生因子； 大鼠

糖尿病的发病率逐年增高，目前糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死、致残的主要原因之一。糖尿病视网膜血管病变的治疗和预防目前仍然是国际上糖尿病治疗的瓶颈和难点。在诸多研究中发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)参与糖尿病血管并发症的发生，且两者之间存在着密切联系，相互影响发挥生物功能，但二者在不同并发症中的作用机制尚无明确的描述[1-3]。本研究通过建立糖尿病大鼠模型和糖尿病合并视网膜病变大鼠模型，了解VEGF和SDF-1在糖尿病视网膜血管病变中的作用机制，为今后糖尿病视网膜血管病变的治疗侧重点提供理论依据。

1　对象与方法

1.1实验对象健康雌性8周龄清洁级SD大鼠120只， 购自新疆医科大学实验动物中心，动物合格证号：(新)20030001，体质量180～200 g，分笼饲养于屏障系统的洁净层流架内，室温控制在(25±1)℃，相对湿度40%～50%。随机分为对照组、糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组、糖尿病合并视网膜病变24 w组，每组30只。

1.2实验方法1.2.1建立实验动物模型运用链脲佐菌素(STZ)注射及脂肪乳灌胃的方法构建动物模型[3]。给予糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组、糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠腹腔注射STZ(60 mg/kg体质量，用0.01 mol/L的枸橼酸盐缓冲液溶解,浓度为10 g/L)，对照组大鼠注射等量生理盐水。注射STZ 4 w后检测血糖，2型糖尿病判断标准为空腹血糖>正常大鼠血糖均值+3个标准差即为糖尿病造模成功，选30只为糖尿病组，造模不成功者予以剔除，其余造模成功的大鼠继续分别普通饮食喂养8 w，给予盐酸氯胺酮(40 mg/kg体质量)麻醉，行托品卡安散瞳，盐酸丙美卡因眼表面麻醉后做眼前节观察及眼底检查，并经尾静脉注射大分子量异硫氰酸葡聚糖荧光素行眼底血管造影，将眼底出现可见微血管瘤的大鼠定为糖尿病视网膜病变模型，确诊视网膜病变后继续普通饮食喂养12、24 w，分别选取各30只大鼠为糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组。干预实验前，从4组制模成功的大鼠中各提取15只大鼠，处死并提取视网膜组织。

1.2.2动物模型干预实验糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组、糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠给予玻璃体内注射VEGF抑制剂贝伐单抗0.05 mL(浓度为25 mg/mL)，每周1次，持续4 w，同时进行脂肪乳灌胃，每天3次，持续4 w；对照组给予玻璃体内注射等量、等频次的生理盐水，普通饮食。4 w后，处死动物提取视网膜组织。

1.3实验指标检测

1.3.1干预前、后视网膜组织病理学检查将干预实验前、后提取的各组大鼠视网膜组织均浸于10%福尔马林中，常规石蜡包埋，连续切片，厚度4 μm，进行HE染色，观察其组织形态与结构。

1.3.2干预前、后各组大鼠视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白的表达检测采用Western blot法检测干预前、后各组大鼠视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白的表达。将各组大鼠的部分视网膜组织浸入生理盐水中，经研磨成为细胞悬液，收集细胞，将400 μL含PMSF的裂解液加入细胞培养板上，培养板置于冰上作用30 min，使细胞完全裂解，提取细胞株的总蛋白，用Bradford法测定蛋白浓度并计算出标准曲线方程，进行Western印迹检测，图片扫描后用Quatity One 软件分析条带灰度值。

1.3.3干预前、后各组大鼠视网膜组织VEGF、SDF-1基因的表达检测应用逆转聚合酶链反应(RT-PCR)检测干预前、后各组大鼠视网膜组织VEGF、SDF-1基因的表达。按TRIzol总RNA提取试剂说明书进行操作，采用Trizol 一步法提取各组大鼠视网膜组织的总RNA, 并经紫外分光光度计测定, 计算提取物RNA浓度，按照逆转录试剂盒合成cDNA,设计VEGF、SDF-1mRNA引物，各引物均由上海生工合成。目的基因VEGF 的双向引物为: 5′-CCGGACGGGCCTCTGAAACCAT-3′和5′-CAGCAGCCCGC ACACCGCATTAG-3′；SDF-1的双向引物为:5′-GATGCCCCTGCCGATTCTTT-3′和5′-GTCCTTTGGGCTGTTGTGCTTACT-3′。RT-PCR反应条件为40℃30 min，94℃1 min，94℃15 s，50℃1 min，72℃1 min,取cDNA 1 μg、10×buffer 2 μL、MgCl24 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、引物100 ng, TagDNA多聚酶 1 U，总体系20 μL，将PCR扩增之后的产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，应用Gel-pro凝胶分析软件对电泳谱带mRNA进行基因表达差异分析。

1.4统计学处理采用SPSS 13.0统计软件包对数据进行处理。多组计量资料数据比较采用F检验,组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组制模大鼠干预前、后视网膜组织的病理学检查结果比较干预前对照组大鼠视网膜组织镜下见视网膜表面光滑，内核层和外核层细胞排列整齐、紧密；糖尿病组大鼠视网膜镜下表现与对照组大致相似，仅见内核层细胞较排列疏松，血管未见明显异常；糖尿病合并视网膜病变12 w组大鼠视网膜镜下可见各层细胞排列不整齐，偶见毛细血管内皮细胞突出内界膜；糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜镜下可见视网膜内界膜水肿明显，各层细胞排列明显不整齐，较多血管内皮细胞突出内界膜(图1)。干预后对照组和糖尿病组大鼠视网膜组织镜下表现与干预前均无明显差异；糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜镜下均可见视网膜内界膜水肿明显减轻，毛细血管内皮细胞突出内界膜的情况明显得到改善(图2)。

2.2各组大鼠干预实验前、后视网膜组中VEGF、SDF-1蛋白及基因的表达比较干预前对照组、糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白及基因的表达均逐渐升高，4组间比较差异有统计学意义(F=8.56、7.46,P<0.05)。干预后4组大鼠的视网膜组织中VEGF、SDF-1蛋白及基因的表达均出现下降，以糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组下降更为明显，4组间比较差异有统计学意义(F=9.06、 7.26,P<0.05)，见图3、图4。

a： 对照组

b： 糖尿病组

c：糖尿病合并视网膜病变12 w组

d：糖尿病合并视网膜病变24 w组

图1干预前各组制模大鼠视网膜组织的病理学检查结果(HE×200)

a： 对照组

b： 糖尿病组

c：糖尿病合并视网膜病变12 w组

d：糖尿病合并视网膜病变24 w组

图2干预后各组制模大鼠视网膜组织的病理学检查结果(HE×200)

1: 对照组； 2： 糖尿病组； 3： 糖尿病合并视网膜病变12 w组； 4： 糖尿病合并视网膜病变24 w组

M: DNA marker; 1: 对照组； 2： 糖尿病组； 3： 糖尿病合并视网膜病变12 w组； 4： 糖尿病合并视网膜病变24 w组

3　讨论

糖尿病是世界范围内严重威胁人类健康的常见病、多发病,以糖、蛋白质、脂肪等一系列物质代谢紊乱为主要特征,其发病与胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛素敏感性降低密切相关，其慢性并发症几乎可以累及全身各个组织器官，眼部并发症是其中发病早、发病率高的并发症之一，且又以糖尿病视网膜病变最为严重。因此，对于糖尿病视网膜病变的研究一直是关注的重点。

目前发现在长期慢性高血糖毒性作用下，糖尿病患者体内多种代谢途径发生紊乱，发生糖尿病视网膜病变，其主要病理改变有毛细血管周细胞数目减少、内皮细胞增生、视网膜毛细血管通透性增加、基底膜增厚致毛细血管管腔狭窄等一系列改变，但对于其病理改变的发生机制至今尚未完全阐明。本研究采用链脲佐菌素诱导及脂肪乳灌胃进行糖尿病及其并发症视网膜病变的制模，SD大鼠在注射STZ后逐渐出现明显的多尿、多饮、多食、消瘦，典型的糖尿病三多一少症状，4 w后检测血糖，2型糖尿病大鼠模型成功建立，并成功建立糖尿病合并视网膜病变12 w组、糖尿病合并视网膜病变24 w组。采用HE染色对制模后大鼠的视网膜结构变化进行了观察，结果发现对照组和糖尿病组大鼠镜下视网膜结果变化大致相似，均未见血管明显异常,说明在糖尿病病程早期，视网膜组织的病理改变并不明显，提示糖尿病视网膜病变是一个长期慢性高血糖毒性作用下的逐渐发展过程。糖尿病合并视网膜病变12 w组大鼠镜下已经可见到视网膜各层细胞发生改变，其各层细胞排列不整齐，且偶见毛细血管内皮细胞突出内界膜；而糖尿病合并视网膜病变24 w组镜下变化更明显，视网膜内界膜水肿明显，各层细胞排列明显不整齐，且较多血管内皮细胞突出内界膜。说明随糖尿病的病程延长和发展，视网膜各层细胞改变以及血管形态结构的病理改变逐渐加重，病程越长，病变改变越明显。提示糖尿病视网膜病变是随病程进展而逐渐发生的，首先是视网膜细胞发生改变，在糖尿病后期才出现视网膜毛细血管通透性增加、基底膜增厚致毛细血管管腔狭窄等一系列视网膜血管形态结构的改变，提示早期干预控制高血糖，并针对糖尿病视网膜病变发生机制进行干预，对延缓糖尿病视网膜病变的发生和发展具有重要意义。

近年通过对动物模型及人的糖尿病视网膜病变研究发现，一些细胞因子在糖尿病视网膜病变发生、发展中起重要作用。其中血管内皮生长因子(VEGF)的促血管新生作用一直是人们的关注点。最初是1989 年由研究者从牛垂体滤泡星状细胞的培养液中分离提取出来的一种分泌蛋白、糖蛋白,并发现其具有促进内皮细胞的生长增殖、促血管通透及诱导血管形成的作用。以往较多动物实验以及体外实验均已经证明了VEGF在内皮细胞生长、增殖以及血管发生上起重要作用[4-5]。目前实验发现VEGF可能参与糖尿病性视网膜病发的发病机制，可能通过其增加血管通透性、使其细胞外基质变性、促进内皮细胞迁移、增殖及新生血管形成等作用而在糖尿病视网膜病变的发生、发展中均发挥了重要作用[6]。1999年Duh等[7]实验检测了增殖型糖尿病变患者玻璃体腔和房水内VEGF的表达水平，不仅发现其表达升高，更进一步发现了VEGF表达水平与视网膜病变的发生、严重程度密切相关。最近研究表明，糖尿病大鼠VEGF水平的降低可使增殖性糖尿病大鼠视网膜病变得到明显改善[8]。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)是由骨髓基质细胞及其他组织的基质细胞分泌释放的一种具有趋化活性的细胞因子,也属于重要的血管生成蛋白之一。最新研究表明，SDF-1不仅广泛参与了体内新生血管形成过程，更可通过促进内皮祖细胞从骨髓向缺血的视网膜处募集而参与糖尿病患者视网膜血管病变的发生发展过程[9-11]，但SDF-1 在调控糖尿病患者血管病变中的作用机制目前尚不明确。SDF-1和VEGF的表达不仅均参与了糖尿病大血管病变和微血管病变过程，而且两者之间甚至可能存在着相互调节的作用，但目前对于二者之间的关系以及作用机制尚无定论。

本研究为了探索VEGF、SDF-1在糖尿病视网膜血管病变中的相关性及其关系，对糖尿病视网膜病变大鼠模型给予VEGF抑制剂进行干预，观察其病变改变以及检测VEGF、SDF-1基因和蛋白表达变化。结果发现，VEGF抑制剂干预后对照组和糖尿病组大鼠视网膜组织镜下表现与干预前均无明显差异；糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠视网膜镜下均可见视网膜内界膜水肿明显减轻，毛细血管内皮细胞突出内界膜的情况明显得到改善。进一步证明了VEGF参与了糖尿病视网膜血管病变的发生、发展过程，阻断VEGF的表达能明显改善视网膜血管病变，因此探讨VEGF对视网膜新生血管的作用可能为糖尿病视网膜血病变治疗提供新的靶点。

本研究进一步检测了视网膜组织中VEGF、SDF-1基因和蛋白表达变化，结果发现VEGF抑制剂干预前对照组、糖尿病组、糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组大鼠的视网膜组织中VEGF、SDF-1基因和蛋白的表达逐渐升高，4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF抑制剂干预后，4组大鼠的视网膜组织中VEGF、SDF-1基因和蛋白的表达均出现下降，以糖尿病合并视网膜病变12 w组和糖尿病合并视网膜病变24 w组下降更明显，4组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。证明了VEGF、SDF-1参与了糖尿病视网膜血管病变的发生，且抑制VEGF表达可以下调SDF-1表达水平，证实这2种细胞因子之间存在密切关系，VEGF对SDF-1的表达具有调节机制，为下一步分析两者之间关系以及相互作用机制提供了有力的实验依据，以求寻找到预防及治疗糖尿病视网膜血管病变的新策略。

[1]徐庆胡，袁源智，王历阳，等．AMD3100 对小鼠高氧诱导视网膜病变中新生血管的抑制作用[J]．中华眼科杂志，2012，48( 4) ：350-355.

[2]Kim KW，Park SH，Lee SH，et al. Upregulated stromal cell-derived factor 1(SDF-1) expression and its interaction with CXCR4 contribute to the pathogenesis of severe pterygia[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(12)：7198-7206.

[3]游逸安，赖中燕，周倩倩.SDF-1 和VEGF 在糖尿病大鼠视网膜病变中的表达及AMD3100干预作用[J]．国际眼科杂志，2013，13(10)：1960-1964.

[4]Thomas RM，Jaquish DV，French RP，et al．The RON tyrosine kinase receptor regulates VEGF production in pancreatic cancer cells[J]．Pancreas，2010，39(3):301 -307.

[5]Zhang D，Li B，Shi J，et al． Suppression of tumor growth and metastasis by simultaneously blocking vascular endothelial growth factor (VEGF)-A and VEGF-C with a receptor-immunoglobulin fusion protein[J]．Cancer Res，2010，70(6):2495-2503.

[6]汪枫桦，姜媛，王雯，等．CXCR4 抑制剂与抗血管内皮生长因子抗体联合应用对实验性脉络膜新生血管形成的干预作用[J]．中华眼底病杂志，2011，27(6)： 553 -556.

[7]Duh E, Aiello LP. Vascular endothelial growth factor and diabetes: the agonist versus antagonist paradox[J]. Diabetes，1999，48(10)：1899-906.

[8]游逸安，许雯怡，朱乐如．增殖性糖尿病视网膜病变玻璃体与血清SDF-1、VEGF 含量分析[J]．医学研究杂志，2013，42(1)： 100-104.

[9]梁玉娥，王建平.SDF-1/CXCR4与糖尿病大血管病变关系的研究[J].现代医药卫生，2014，30(4)：528-530.

[10]Huang C， Gu H， Zhang W， et al. SDF-1/CXCR4 mediates acute protection of cardiac function through myocardial STAT3 signaling following global ischemia/reperfusion injury[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301(4)：H1496-1505.

[11]Li LX，Zhang XF，Bai X，et al. SDF-1 promotes ox-LDL induced vascular smooth muscle cell proliferation[J]. Cell Biol Int，2013，37(9)：988-994.

(本文编辑杨晨晨)

The mechanism of VEGF and SDF-1 in the development of diabetic retinal vascular lesions

GAO Jing1, LIU Xiao2, WANG Minzhe1, LIU Guanying1, YANG Xuesong1

(1DepartmentofEndocrinology,theFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2PacemakerInterventionalDiagnosisandTreatmentCenter,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo measure mechanism of VEGF and SDF-1 in the development of diabetic retinal vascular lesions． MethodsThe gastric diabetic rats model and the rat model with diabetic retinopathy were constructed by the chain urea with cephalosporins (streptozocin, STZ) and fat emulsion injected. Rats were randomly divided into control group, diabetes group, diabetic retinopathy 12 w, diabetic retinopathy 24 w group, and 30 rats in each group. All rats were injected with bevacizumab to intervene. After 4 weeks, the rats were killed and the retinal tissue were extracted. The pathology change of retinal tissue before and after intervention were observed the expression of VEGF and SDF-1 gene and protein in retinal tissue of rats were detected. ResultsBefore intervention, the pathology change of control group and diabetes group were similar, there were no obvious abnormal vessels. In diabetic retinopathy 12 weeks group, each layer cells in the rat retina were irregular arrangement and a little capillary endothelial cells were out of the occasional border membrane. In diabetic retinopathy 24 weeks group, boundary membrane were obviously edema and irregular arrangement of each layer cell membrane was more, and more capillary endothelial cells were prominent out of the border membrane. After the intervention, there were no obvious difference in the pathology change between control group and diabetes group. In diabetic retinopathy 12 weeks group and diabetic retinopathy rat retina microscopically 24 weeks group, the edema in the retina boundary membranewere obviously lightened, the capillary endothelial cells out of the boundary membrane were significantly reduced. Before the intervention, the expression of VEGF and SDF-1 protein and gene in the control group,diabetes group, diabetic retinopathy 12 weeks group and diabetic retinopathy 24 weeks group were increased in sequence, and there were significant differences (F=8.56, 7.46, P<0.05). After the intervention, the expression of VEGF and SDF-1 protein and gene in the retinal tissue of four groups, the control group, diabetes group, diabetic retinopathy 12 weeks group and diabetic retinopathy 24 weeks group, were decreased gradually, especially in diabetic retinopathy 12 weeks group and diabetic retinopathy 24 weeks group, and there were significant differences (F=9.06, 7.26, P<0.05). ConclusionVEGF, SDF-1 was involved in the occurrence of diabetic retinal vascular lesions. Blocking the expression of VEGF can obviously improve the retinal vascular lesions, and inhibiting the expression of VEGF expression can cut the expression of SDF-1.

diabetic retinal vascular lesions; vascular endothelial growth factor; stromal cell derived factor; rats

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C129)

高静(1981-)，女，在读博士，主治医师，研究方向：糖尿病及其并发症的发病机制。

王敏哲，主任医师，副教授，研究方向：糖尿病血管并发症的发病机制，E-mail：wangminzhe2010@163.com。

R587.2

A

1009-5551(2016)10-1286-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.018

2015-04-18]