阿里红提取物对Aβ25-35致痴呆动物模型学习记忆障碍和海马乙酰胆碱酯酶活性的影响

帕丽达·阿不力孜， 木卡德斯·哈力克， 艾合麦提·图尔贡， 丛媛媛， 米仁沙·牙库甫

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐　830011)



阿里红提取物对Aβ25-35致痴呆动物模型学习记忆障碍和海马乙酰胆碱酯酶活性的影响

帕丽达·阿不力孜， 木卡德斯·哈力克， 艾合麦提·图尔贡， 丛媛媛， 米仁沙·牙库甫

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐830011)

目的观察阿里红提取物对Aβ25-35诱导老年性痴呆大鼠的学习记忆力和海马乙酰胆碱酯酶活性的影响。方法采用侧脑室注射凝聚态Aβ25-35蛋白诱导老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)的大鼠模型。取SD大鼠60只，随机分为对照组、模型组(11.5 μ mol/L Aβ25-35)、阿里红提取物低剂量(11.5 μmol/L Aβ25-35+0.25 mg/kg阿里红乙酸乙酯部位)组、阿里红提取物中剂量(11.5 μ mol/LAβ25-35+0.5 mg/kg阿里红乙酸乙酯部位)组、阿里红提取物高剂量(11.5 μmol/L Aβ25-35+1 mg/kg阿里红乙酸乙酯部位)组5组。对照组及模型组动物每天固定时间分别给予5 μL的生理盐水和Aβ25-35，阿里红提取物各剂量组动物分别给予相应剂量的药物。SD大鼠连续给药10 d后，用Morris水迷宫方法对动物进行空间记忆能力测试；采用HE染色法观察各组大鼠神经元病理形态的改变；测定受试动物大脑海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)含量。结果与模型组比较，阿里红提取物高、中、低剂量组大鼠逃逸潜伏期明显缩短，目标象限停留时间明显延长，穿越平台次数增加，差异有统计学意义(P<0.05)；阿里红提取物高、中、低剂量组大鼠海马神经细胞数量明显增多，AChE活性明显降低。 结论阿里红提取物乙酸乙酯部位能改善Aβ25-35诱导所致AD大鼠学习记忆能力障碍，亦能降低脑内乙酰胆碱酯酶活性。

阿里红提取物； β-淀粉样蛋白； 痴呆； 乙酰胆碱酯酶； 学习； 记忆

阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease，AD) 又称Alzheimer型老年痴呆症，是神经系统变性疾病的总称， AD发病率在85岁以上的老年人中约占47%，这不但严重影响了人们的生活质量，也随之带来一系列的社会问题[1-2]。AD 的大部分病理性质是老年斑( SP) 或者神经原纤维缠结( NFT ) 以及海马皮层部分为主的神经元遗失 。AD发病的机制与Aβ淀粉样蛋白级联学说、胆碱能假设、神经细胞元衰退学说、Tau蛋白过度磷酸化假设等学说有关。β类淀粉蛋白(Aβ)认为是阿尔茨海默病的最主要致病原因之一[3-6]。阿尔茨海默病发生时脑内的胆碱能神经元数量减少，导致乙酰胆碱含量的下降，也是AD治疗获得有限疗效的重要基础。

阿里红(Fomes officinalis Ames.)是多孔菌科药用层孔菌的干燥子实体，为维吾尔族医生的常见药物，具有温肺祛痰、降气平喘以及利尿消肿等有功效，民间用于治疗慢性支气管炎、腹痛、感冒、肺结核以及癌症[7]。相关研究报道阿里红具有抗衰老、免疫调节[8]、清除氧自由基及抗DNA氧化损伤、抗肿瘤及平喘祛痰[9-10]等作用。阿里红提取物乙酸乙酯部位是课题组获得的对PC12细胞有明显增殖的活性部位[11]。前期的实验证明，阿里红提取物对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞有显著增殖作用，提示具有神经保护作用。本研究建立动物痴呆模型，初步研究了阿里红提取物对痴呆动物学习记忆能力的改善作用，以及对大脑海马组织乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响，为阿里红药效的进一步开发提供依据。

1　材料与方法

1.1仪器与材料

1.1.1仪器与试剂Morris水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟科技有限公司， MT-200Morris)，脑立体定位仪(第二军医大学产品，江湾I型C)，倒置显微镜(Leica公司， IX71)，5 μL微量进样器(上海浦伦医疗器械有限公司)，乙酰胆碱酯酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 20060328)，Aβ25-35蛋白(美国Sigma公司，批号：054M4822V)，水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司，批号：W20000218)。阿里红提取物为本实验室自制。

1.1.2实验动物正常雄性SD大鼠60只，体质量200～300 g，许可证号：SYXK(新)2011-0001。大鼠用全价颗粒饲料进行喂养，每天换水换饲料，动物饲养室温度保持在20～25℃，相对湿度范围为35%～50%。

1.2方法

1.2.1动物分组及造模方法取SD大鼠60只，随机分为5组：对照组、模型组(11.5 μmol/L Aβ25-35)、阿里红提取物低剂量组(11.5 μmol/L Aβ25-35+0.25 mg/kg乙酸乙酯部位)、阿里红提取物中剂量组(11.5 μ mol/LAβ25-35+0.5 mg/kg乙酸乙酯部位)、阿里红提取物高剂量(11.5 μmol/L Aβ25-35+1 mg/kg乙酸乙酯部位)。模型组制备方法：SD大鼠经10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体质量)腹腔注射麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上保持前后囟在同一水平，参照大鼠脑立体定位图谱选择右侧海马齿状回为注射靶区，定位坐标为前囟向后6～9 mm，中线旁开1.3 mm，硬脑膜下 5 mm。用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自硬脑膜表面垂直进针，用微量注射器注射Aβ25-355 μL，缓慢注射，注射完后留针5 min；阿里红提取物低、中、高剂量组：先注射5 μL Aβ25-35， 10 min后注入不同浓度的阿里红提取物5 μL，注射完后留针10 min以保证其充分弥散，缓慢撤针，缝合消毒。对照组侧脑室注入5 μL生理盐水。

1.2.2大鼠学习记忆能力的测定[12-13]将不同组大鼠造模10 d以后进行Morris水迷宫实验，造模后10 d之内大鼠的成活率80%。实验时间为5 d，以定位航行、空间探索为指标。定位航行实验连续进行4 d，观察和记录实验动物寻找并爬上平台所需时间，即潜伏期。最后1 d 进行空间探索实验，记录动物第1次到达原平台位置的时间、穿越原平台的次数以及在目标象限活动的时间百分比。

1.2.3大鼠脑组织内AChE活性测定Morris水迷宫实验结束后，将大鼠断头，取出大脑；迅速分离海马，按所取海马的重量，放入9倍重量的冰冷生理盐水制备10%脑组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，提取上清液。根据AchE活性测试盒的说明书测定脑组织中AchE的活性；用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。

2　结果

2.1阿里红提取物对Aβ25-35所致学习记忆障碍大鼠学习记忆的影响与对照组比较，模型组(Aβ25-35组)大鼠游迷宫所需时间明显长于对照组，平均逃逸潜伏期呈增加趋势(P<0.05)，提示Aβ25-35能够破坏大鼠的学习能力。阿里红提取物各剂量组大鼠游迷宫所需时间明显短于模型组(P<0.05)。见表1、图1。

表1　阿里红提取物对AD大鼠逃逸潜伏期的影响(±s， n=8)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

a: 对照组大鼠运动轨迹

b: 模型组大鼠运动轨迹

c： 阿里红低剂量组大鼠运动轨迹

d: 阿里红中剂量组大鼠运动轨迹

e: 阿里红中剂量组大鼠运动轨迹

图1AD组大鼠第5天定位航行实验轨迹图

2.2阿里红提取物对Aβ25-35所致学习记忆障碍大鼠空间探索能力的影响与对照组比较，模型组大鼠穿越平台次数呈现下降趋势，在目标象限停留时间明显减少(P<0.01)。阿里红提取物高、中、低剂量组大鼠穿越平台次数增加，在目标象限停留时间均明显增加，与模型组比较差异有统计学意义( P<0.05)。空间探索和定位航行实验的结果提示阿里红提取物可以改善AD的空间学习记忆能力，见表2。

表2　阿里红提取物对AD大鼠穿越平台次数及目标象限持续时间的影响(±s， n=8)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3大鼠海马神经细胞HE染色结果与模型组比较，阿里红提取物组锥体细胞数目明显增多，形态也较完整，海马锥体细胞层结构紧密性明显改善，空泡样变性有所减少，胶质细胞浸润现象减轻，提示阿里红提取物对Aβ25-35毒害的神经细胞有明显的保护作用；而对照组大鼠脑切片染色中并未发生明显的损伤表现，细胞核大而圆，核仁分明，锥体细胞层次鲜明结构紧凑。

模型组正常锥体细胞数目有急剧减少，海马神经元破裂情况较严重，细胞核固缩，阿里红提取物各组的椎体细胞数目均增加明显，海马神经元的破裂程度减少，其中高、中、低剂量3组均有明显增多(P<0.05)，结果表明阿里红提取物可以保护锥体细胞免受Aβ25-35的毒害，见图2、表3。

2.4阿里红提取物对Aβ25-35所致学习记忆障碍大鼠脑组织内胆碱酯酶活性的影响与对照组比较，模型组大鼠海马组织中AChE活性明显升高(P<0.001)。阿里红提取物高、中、低剂量组海马组织中AChE活性明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示阿里红提取物3个剂量组可以明显降低大鼠AChE活性。模型组大鼠大脑组织匀浆中蛋白含量明显下降(P<0.001)，与模型组相比，阿里红提取物3个剂量组AD大鼠脑组织蛋白含量明显升高(P<0.05)，见表4。

组别剂量/(mg/kg)锥体细胞数目/个对照组-115.50±8.54模型组-56.45±5.65*阿里红提取物低剂量组0.2578.45±4.55△阿里红提取物中剂量组0.5096.84±5.45△阿里红提取物高剂量组1.00106.85±4.85△

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，△P<0.05。

组别剂量/(mg/kg)蛋白含量/(mg/mL)AchE活力/(U·mg-1·pro)对照组-14.05±4.260.242±0.048模型组-7.45±1.25*0.508±0.064*阿里红提取物低剂量组0.258.35±1.58△0.370±0.047△阿里红提取物中剂量组0.509.85±1.05△0.325±0.026△阿里红提取物高剂量组1.0011.05±1.14△0.286±0.021△

注：与对照组比较，*P<0.05； 与模型组比较，△P<0.05。

3　讨论

AD患者的早期主要症状表现为智力减退，近期记忆缺失，以及相关行为能力障碍。因此，研究学习记忆能力往往是阿尔茨海默病的诊断以及疗效评价的主要影响因素之一。AD的病理变化与老年斑的形成、神经纤维缠结并伴随胆碱能神经元的丢失有关。β-淀粉样蛋白是老年斑的成分之一。当大量β-淀粉样蛋白在大脑内沉积时，形成神经毒性，可损害胆碱能神经元从而导致学习记忆能力下降。本研究采用侧脑室海马区注射Aβ25-35形成老年痴呆大鼠动物是目前临床前药效学评价的常用模型[14]。Morris水迷宫是英国心理学家Morris在20世纪80年代初设计并广泛应用于观察大鼠空间学习记忆的一种装置。可以系统、全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平；将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来，减少它们对学习记忆过程检测 的干扰，具有操作简便，数据误差小等优点。本研究实验结果表明，模型组大鼠游迷宫所需时间明显长于对照组，提示Aβ25-35具有神经毒性，可模拟痴呆长时记忆障碍特征，表明本实验动物模型造模成功。采用 Morris水迷宫进行测试，试验结果表明模型组小鼠Morris水迷宫试验的学习记忆能力明显下降，表现为找到站台所需时间和距离较对照组延长。

a :对照组

b: 模型组

c: 阿里红提取物低剂量组

d: 中剂量组阿里红提取物

e: 阿里红提取物高剂量组

图2阿里红提取物对AD大鼠海马区神经元凋亡的影响(HE×100)

空间探索实验是大鼠在Morris水迷宫实验中穿越平台的次数和目标象限持续时间，代表着大鼠的记忆能力，穿越平台次数越多，目标象限持续时间越长，表明大鼠的记忆能力越强。与对照组相比，模型组大鼠的穿越平台次数明显降低(P<0.01)，在目标象限持续时间明显缩短，其运动轨迹图显示在各个象限，不集中于目标象限，表明大鼠记忆能力受损严重；与模型组比较，阿里红提取物3个剂量组大鼠的穿越平台次数增多(P<0.05)，在目标象限持续时间均明显延长，运动轨迹图显示逐渐集中于目标象限内，差异具有统计学意义(P<0.05)。

增强胆碱能系统功能而改善患者的认知和记忆障碍是目前阿尔茨海默病治疗最有效的方法之一，表明其记忆功能障碍与脑内胆碱能神经元受损严重密切相关。本研究结果表明经大鼠侧脑室微量注射阿里红提取物后，大鼠的胆碱能系统发生有一系列变化，胆碱能标志酶指标得到改善，明显提高了ChAT的表达能力，而且明显降低AChE的活性。本结果提示阿里红提取物对胆碱能系统有保护作用，通过降低AChE活性及增强ChAT表达能力，可以减轻Aβ25-35对胆碱能神经元的损害。本研究发现，3个实验剂量的阿里红提取物乙酸乙酯部位均能改善痴呆动物的学习记忆功能，并能降低模型组脑组织中AChE活性。

综上所述，本研究的结果提示阿里红提取物对Aβ沉积引起的痴呆动物模型学习记忆功能的改善作用可能是通过抑制大脑AChE活性，增强胆碱神经元功能产生的。

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(本文编辑杨晨晨 )

Effects of extract of Fomes officinalis on spatial memory and acetylcholinesterase active in AD models

Palida Abulizi, Makadesi Halike, Aihemati Tuergong， CONG Yuanyuan, Mirensha Yakufu

(CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

ObjectiveTo observe the effects of Fomes officinalis extract on ability of memory and acetylcholinesterase activity in AD rats induced by Aβ25-35. MethodsAll groups except the control were injected Aβ25-35into the lateral cerebral ventricle. 60 rats were randomly divided into 6 groups：the control group，the model group and 3 experimental drug treated groups． Both control and model group were treated with appropriate dose of saline, 3 experimental drug treated groups were treated with appropriate dose of Fomes officinalis ethyl acetate at fixed time every day. After administration for 10 days, the ability of memory of rats was tested by the water maze method and the content of AChE was measured by Acetylcholinesterase Reagant Kit； Pathological changes of neurons in each group were observed with HE staining. ResultsCompared 3 experimental drug treated groups with the model group, the escape latency was significantly shortened, the residence time of target quadrant were significantly prolonged, the times of passing through the platform were significantly increased (P<0.05)；The number of nerve cells in hippocampus increased obviously, the activity of AChE of 3 experimental groups was obviously lower than that of model group (P<0.05). ConclusionFomesofficinalisextract of ethylacetate can improve the studying memory of the AD rats induced by Aβ25-35and can also reduce the activity of AChE．

Fomesofficinalisextract; Aβ25-35； dementia; acetylcholinesterase; study; memory

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C012)

帕丽达·阿不力孜(1962-)，女(乌孜别克族)，博士，教授，博士生导师，研究方向：维吾尔药药效物质基础研究，E-mail:palida3345@163.com。

R966

A

1009-5551(2016)10-1310-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.024

2016-05-16]