防治烟草黑胫病内生细菌的分离鉴定及促生作用研究

岳耀稳 王丽萍 张仲友

摘要 通过常规分离方法、平板对峙培养法从健康烟株的根、茎、叶中分离得到内生细菌127株，从中筛选出8株菌株对烟草黑胫病菌有明显抗性，并对其进行了皿内拮抗试验、发酵液抑菌试验、温室盆栽试验和发酵液浸种、灌根试验，结果表明：8个菌株培养液滤液中存在具有明显抑菌作用的活性成分。以菌株wy11对烟草黑胫病的防效最好，防效为51.7%。菌株wy2发酵液浸种对烟草幼苗有显著促生作用，能显著提高地上部分鲜重、茎围、根长、叶长、叶宽。

关键词 烟草黑胫病病原菌；内生细菌；分离鉴定；促生作用

中图分类号 S435.72 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）09-0120-03

烟草黑胫病是土传真菌病害，在我国各产烟省均有不同程度的发生[1]。筛选有益的内生细菌有可能成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌等加以利用[2]。因此，通过对皖南各烟区大量采样，分离出多种内生细菌，筛选出有效的黑胫病拮抗菌株，并对其促生作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 供试烟草品种及菌株

内生细菌为云烟87、云烟97、云烟99、K326共4个品种的烟草植株成熟期的根、茎及不同生长期的叶片等组织进行采样并分离获得。菌株为烟草黑胫病（病原）菌162。

1.2 主要试剂及培养基

内生细菌DNA提取、16S rDNA片段扩增、Marker、dNTPs、Buffer等试剂为宝生物工程（大连）产品；其余试剂均为国产分析纯。内生细菌分离和培养用改良的NA（牛肉浸膏1.0 g，酵母浸出汁3.0 g，琼脂17.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0）、液体培养用LB，烟草黑胫病菌的培养用CA[3]。

1.3 烟草内生细菌的分离、纯化、保存、编号规则

采集4个品种烟草不同生长期长势良好无病烟株的叶及成熟期的根和茎，对分离菌株进行统一编号。如cg3，数字前2个小写英文字母分别代表分离时期、烟草器官的缩写（表1），数字代表分离序号。

2 结果与分析

2.1 烟草内生细菌的分离与平板抑制作用

对内生细菌的分离结果发现，培养基上长出大量菌落，菌落形态存在明显差异，说明烟草组织中不仅存在大量的内生细菌，且内生细菌的种类丰富（图1）。从4个品种烟草一共分离纯化出127株内生细菌，并从中筛选出了26个菌株对烟草疫霉菌有平板拮抗作用（表2），12个菌株对烟草黑胫病菌有较強拮抗作用（表3），其抑菌带清晰透明，宽度均达到5 mm以上（图2）。

从表3、图3可以看出，对烟草黑胫病菌抑菌活性与空白对照相比，除了cg16、cj22、wy3、wy5无显著差异外，其余8个菌株的抑菌活性均达显著水平。

2.2 拮抗内生细菌对烟草黑胫病的盆栽防效

参试菌株共8个烟草内生细菌，分别为cg24、cj27、cj17、cj20、wy2、wy11、wy4、wy16。从表4可以看出，在接种病菌后第14天，各处理均不同程度地发病。除菌株cj27外，其他7株均显示出一定的防病效果，为6.5%～51.7%。其中以wy11表现突出，病情指数为33.3，防效为51.7%。由此说明，生防菌wy11对黑胫病的防效最佳。

2.3 拮抗细菌的促生作用测定

2.3.1 拮抗内生细菌对种子萌发及根长的影响。选择对烟草黑胫病菌有较强拮抗活性的8个分离菌株为测试菌株，发现8株细菌菌液处理的烟草种子都能正常发芽和生长，表明8株细菌不是烟草的致病菌。表5显示各菌液处理组发芽率与对照无差异，说明8个菌株菌液处理对种子萌发没有显著影响。14 d后测量根系长度，结果表明，大部分菌株对根的生长有促进作用，根长都高于对照。菌液处理组烟苗根长分别增长0.9%～30.3%（表5）。尤以wy2最为明显，总根长达30.1 cm。利用DPS软件进行统计分析，在α=0.05水平上，wy2的促进作用最显著。根长比LB对照增加30.3%，与清水（CK）和LB对照相比，差异达到显著水平（图4）。由此可见，wy2浸种处理后，对烟草有明显的促生作用，表现为显著的促进根伸长，具有进一步开发的意义[4-6]。

2.3.2 拮抗细菌培养液灌根对烟草苗期生长的影响。经内生细菌10倍wy2发酵液浸种处理后，相比10倍LB和清水对照，烟草幼苗地上部分鲜重、根长、茎围、最大叶长、叶宽均有一定程度的增加。从表6可以看出，地上部分鲜重、根长、茎围与对照间差异性达到显著水平。表明内生细菌wy2发酵液对烟草幼苗有明显的促生作用，有利于植株后期的健康生长（图5、6）。

3 结论与讨论

试验结果表明，除菌株cj27外，其他7株内生细菌处理均显示出一定的防病效果，其中以wy11表现突出。大部分拮抗内生细菌菌液对根的生长有促进作用，尤以wy2最为明显，其发酵液对烟草幼苗有明显的促生作用。通过筛选，获得了1株有一定防病效果的内生细菌wy11，对烟草黑胫病的生物防治研究具有一定的指导意义[7-8]。因此，wy11和wy2菌株在烟草防病促生方面具有潜在的应用价值，但其实用发酵条件、防病促生机理、大田应用效果等还需进一步研究。

4 参考文献

[1] 孔凡玉，朱贤朝，石金开，等.我国烟草侵染性病害发生趋势及防治对策[J].中国烟草科学，1995（1）：31-34.

[2] 刘峰，蒋宇扬，刘世英，等.植物内生菌抗虫工程研究进展[J].生物技术通讯，2004，15（4）：417-419.

[3] 方中达.植病研究方法[M].北京：中国农业出版社，1998：49.

[4] 林玲，乔勇升，顾本康，等.植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展[J].江苏农业学报，2008，24（6）：969-974.

[5] 马冠华，周常勇，肖崇刚，等.烟草内生细菌Itb57的鉴定及其对烟草黑胫病的防治效果[J].植物保护学报，2010（2）：148-152.

[6] 蒋继志，张蕾，刘璇，等.致病疫霉拮抗内生细菌的筛选及离体防病作用[J].河北农业大学学报，2013，36（2）：75-79.

[7] 杨海莲，孙晓璐.植物根际促生细菌和内生细菌的诱导抗病性的研究进展[J].植物病理学报，2000，30（2）：106-110.

[8] 王万能，全学军，肖崇刚.烟草内生细菌对烟草病害的拮抗和防治作用[J].烟草科技，2006（1）：54-57.