Rho GTPase/ROCK信号通路在皮肤病免疫调节中的研究进展

张利平，何焱玲



Rho GTPase/ROCK信号通路在皮肤病免疫调节中的研究进展

张利平，何焱玲

张利平

在皮肤血管炎和皮肤肿瘤的免疫调节中，Rho GTPase/ROCK信号通路对T淋巴细胞的调节作用受到越来越多的重视。该通路主要影响细胞骨架重排及细胞运动。近年来研究表明，在系统性红斑狼疮、白塞病及黑素瘤的发病机制中，Rho GTPase/ROCK信号通路通过影响T淋巴细胞的黏附迁移、激活、效应等方面，进而影响免疫反应的发生。目前已有一些Rho GTPase/ROCK信号通路的抑制剂如Y27632、法舒地尔等应用于基础或临床研究中，并取得了一定的成果，有望成为治疗疾病的潜力药物，且近年来越来越多的证据还表明ROCK抑制剂在皮肤愈合和瘢痕治疗中发挥作用。

Rho GTPase/ROCK信号通路；T淋巴细胞；血管炎，皮肤；黑素瘤

［J Pract Dermatol， 2016， 9（4）：259-261］

在皮肤血管炎和皮肤肿瘤的发病的机制中，T淋巴细胞介导的免疫反应发挥着重要的作用。近年来分子生物学机制研究表明，Rho相关性卷曲蛋白激酶（Rho GTPase/ROCK）信号通路参与T淋巴细胞介导的免疫反应，介导上述疾病的发病。研究Rho GTPase/ROCK信号通路对于细胞免疫的调节，有利于为皮肤疾病的免疫调节提供新认识。

1 Rho GTPase/ROCK信号通路

在细胞中，Rho GTPase是Ras超家族的一个子集，包括20多种细胞内信号蛋白，如RhoA、Cdc42和Rac1等［1］。Rho GTPase在GTP结合活化状态和GDP结合非活化状态之间转化，起到分子开关的作用，控制着多种生物学行为如细胞增生、基因表达、细胞游走及细胞凋亡［2］。ROCK是RhoA的底物分子，是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Rho GTPase/ROCK信号通路主要通过影响细胞内肌动蛋白骨架动态变化和某些信号传导，进而影响T淋巴细胞介导的免疫反应。该通路可以被鸟嘌呤核苷酸交换因子（活化因子）、Rho GTP酶活化蛋白（抑制因子）所调节。

2 Rho GTPase/ROCK信号通路影响T淋巴细胞功能

2.1 影响T淋巴细胞的迁移

在免疫反应的最初阶段，T淋巴细胞从血管内迁移到组织中离不开细胞本身的极化和跨内皮细胞运动。Heasman等［3］通过使用RNA干扰筛选技术，证实了RhoA在该运动中发挥重要作用，同时发现RhoA耗竭会导致T淋巴细胞前缘和尾端结构极性不显著，细胞凸起和收缩的特定部位也消失，导致T淋巴细胞迁移极性消失；随后又利用Rho活性生物传感器成像系统发现，RhoA在细胞前缘局部激活后，才会产生细胞运动如延伸和收缩。细胞收缩离不开ROCK激活及肌动-肌球蛋白收缩［4］。正常的T淋巴细胞的皱褶主要发生在凸起的前端，这表明T淋巴细胞前端扩展及肌动蛋白丝的动态变化离不开RhoA/ROCK信号通路的激活。在实验水平上证实了该通路通过改变细胞骨架的动态性，进而影响T淋巴细胞的迁移。

2.2 影响T淋巴细胞的激活

Rho GTPase/ROCK信号通路通过调节树突状细胞（dendritic cell，DC）与T淋巴细胞间的相互作用，进而影响细胞免疫反应。DC和T淋巴细胞相互作用离不开特殊结构即免疫突触（immune synapses， IS）。IS是免疫细胞间高度结构化、分子化的接口，DC与T淋巴细胞间IS形成可以激活T淋巴细胞［5］。Malinova等［6］利用共聚焦电子显微镜技术揭示了DC中肌动蛋白参与IS的形成、稳定和功能的发挥。同样，Markey等［7］利用成像流式细胞术也证实了体外条件下DC和CD4+T淋巴细胞可形成IS，该过程涉及丝状肌动蛋白的聚合。

为了揭示Rho GTPase/ROCK信号通路在IS形成的机制，研究表明Myo9b是该过程中不可或缺的调节蛋白。Myo9b是肌球蛋白超家族中一员，其分子结构的尾端有Rho GTPase活化结构域，是Rho GTPase靶蛋白，可以负性调节DC中的RhoA。Xu等［8］利用Myo9b-/-缺陷鼠动物模型观察到，相对于对照组小鼠，实验组DC中RhoA活性增加，使得肌球蛋白轻链磷酸化水平提高，影响了DC和T淋巴细胞的相互作用；另一方面，Myo9b-/-缺陷鼠DC中Rho GTPase/ROCK信号通路过度活化，DC迁移受到影响，DC与T淋巴细胞接触的个数和对照组相比，明显减少；再者Myo9b主要存在于肌动蛋白聚合的地方，在实验鼠免疫突触间隙中肌动蛋白的含量明显减少，改变了DC与T淋巴细胞间的结合力，影响了T淋巴细胞的激活，而且T淋巴细胞活化所依赖的表面分子CD25、CD69表达明显降低，T淋巴细胞增生明显减少。在实验水平上证实了Rho GTPase/ROCK信号通路通过影响IS的形成，影响T淋巴细胞的激活。

2.3 影响T淋巴细胞的效应

ROCK在调节T淋巴细胞介导的免疫效应方面起着重要作用。最近研究表明：Th17偏移刺激CD4+T淋巴细胞ROCK的活化，使白细胞介素（IL）-17及IL-21分泌增多［9］。Zanin-Zhorov等［10］发现健康人服用ROCK抑制剂KD025后，T淋巴细胞分泌IL-17及IL-21水平下降，具体机制在于一方面是ROCK通路受到抑制后，T淋巴细胞内信号转导和转录活化因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）磷酸化水平降低，IL-17、IL-21启动子结合率降低，蛋白水平表达下降；另一方面通过上调STAT5磷酸化、叉状螺旋转录子（FOXp3）基因表达增加，使得调节性T淋巴细胞抑制能力增强，最终导致IL-17及IL-21分泌降低。

同样，Isgro 等［11］也证实了CD4+T淋巴细胞在Th17偏移情况下，ROCK信号通路活化，引起IL-17、IL-21产生增多。具体机制涉及到Rho信号转导通路调节基因（Def6）。Def6-自身免疫性疾病中，RhoA信号通路特异性转录因子可以无限制的结合在IL-17、IL-21基因调节位点，使IL-17、IL-21的产生降低［12］。以上说明，ROCK异常活化影响T淋巴细胞的效应，在自身免疫疾病中发挥重要作用。

此外有研究证实，ROCK通路还可以上调转录因子，如核因子-κB表达，进而活化T淋巴细胞介导的免疫反应。而且，RhoA/ROCK信号通路活化后可以激活p38丝裂原活化蛋白激酶，后者可以上调IL-4、IL-10、干扰素（IFN）-γ的产生，进一步影响T淋巴细胞的分化和免疫反应［13］。

3 Rho GTPase/ROCK信号通路在皮肤疾病中的新认识

3.1 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮（systemic lupus eythematosus，SLE）是T淋巴细胞参与的、以自身抗体产生和多脏器受累为主要特征的自身免疫性疾病。最新研究表明，SLE患者血清中由Th17细胞分泌的IL-17、IL-21水平增加［14］。Biswas等［15］利用经典MRL/lpr狼疮鼠动物模型，给予ROCK抑制剂后发现IL-17、IL-21减少，自身抗体及免疫复合物的沉积减少，蛋白尿的症状得到改善，狼疮鼠肾脏受累得到改善。鉴于SLE是由多基因和多信号转导引发的疾病，尚无任何单一的小鼠模型可以模拟人类SLE的复杂性，Stirzake等［16］利用NZB/W F1雌性狼疮鼠进行动物实验，给予实验鼠法舒地尔（ROCK抑制剂），对照组不做处理，20周后，实验组狼疮鼠的存活率提高，狼疮肾炎的症状明显改善，同时，脾脏效应/记忆CD4+T淋巴细胞降低。进一步说明了ROCK参与了SLE的发病。此外，Crispin等［17］还发现SLE患者T淋巴细胞表达CD44增加，CD44涉及到T淋巴细胞的黏附和迁移，参与狼疮肾炎的发病。增加的CD44导致ROCK活化［18］，使IL-17产生增多。

3.2 白塞病

白塞病（bechet's disease，BD）是一种慢性复发性系统性血管炎，发病涉及到复杂的遗传背景［19］。BD病的全基因分析已确定了疾病易感基因位点。Oguz等［20］进行了一项大样本病例对照研究，该实验纳入194例BD患者，276例健康对照组，使用BioMark体系动态系统评估基因多态性，利用rt-PCR方法检测ROCK的基因表达。结果表明BD患者中ROCK mRNA表达水平增加，编码ROCK基因位点（rs35768389、rs1515219）的基因多态性和BD发病相关，这两个基因位点可能是发展到BD的高风险因素。ROCK基因多态性可以作为早期BD患者的预测指标。

3.3 黑素瘤

黑素瘤是免疫原性肿瘤，可以表达肿瘤抗原和效应分子，后者通过影响机体识别机制导致肿瘤的免疫逃逸，具体机制为肿瘤细胞表达Fas配体异位，免受Fas+淋巴细胞杀伤，造成免疫逃逸［21］。既往研究表明RhoGTPase/ROCK信号通路可使黑素瘤B16F10细胞Fas配体表达下调。Teiti等［22］通过体内实验发现，ROCK抑制剂作用于B16F10细胞，造成Fas配体膜表面过表达而延缓黑素瘤的生长，组织病理学分析表明，实验组CD8+T淋巴细胞在肿瘤细胞内浸润增强。

此外，Kedziora等［23］证实了Rho GTPase/ ROCK信号通路可以减弱肌动蛋白富集区的形成，延缓肿瘤入侵。肌动蛋白富集区膜突组装成花环样结构，可以降解细胞外基质，驱动肿瘤细胞的入侵。不同的G蛋白偶联受体激动剂如溶血磷脂酸和内皮素可以加快黑素瘤细胞的花环样结构。Rho GTPase/ROCK通过减弱溶血磷脂酸及内皮素的形成，拮抗该富集区的结构，使用通路抑制剂后加快了花环样结构形成。以上表明，Rho GTPase/ ROCK信号通路在黑素瘤发病中起到重要作用。

4 ROCK抑制剂在皮肤科的应用

Y27632 和法舒地尔均是ROCK抑制剂，越来越多的证据表明ROCK抑制剂在皮肤创伤愈合和瘢痕挛缩中起重要作用。Gandham等［24］在体外实验发现Y27632可以促进角质形成细胞（keratinocyte，KC）的增生，加快伤口的愈合。此外，Y27632还抑制成纤维细胞介导的胶原收缩［25］，影响瘢痕形成，对于瘢痕疙瘩的治疗提供了可能。此外Bond等［26］还证实，在体外情况下，瘢痕组织在修复的重塑期RhoA表达增加，法舒地尔可以抑制成纤维细胞的收缩、肌成纤维细胞的形成，进而影响瘢痕的形成和收缩。

5 结语

Rho GTPase/ROCK信号通路在皮肤血管炎和皮肤肿瘤的发病机制中起重要作用。主要通过影响T淋巴细胞游走、迁移、活化及效应等方面影响免疫反应的发生。该通路的抑制剂如Y27632、法舒地尔除了在上述疾病治疗方面起到一定作用，还可以促进皮肤伤口愈合、抑制瘢痕形成。但由于Rho GTPase/ROCK通路的分子机制尚未完全阐明，并且动物模型和人皮肤组织存在差异，因此该通路抑制剂对于人皮肤疾病的治疗仍需进一步完善。

［1］ Byrne KM， Monsefi N， Dawson JC， et al. Bistability in the Rac1， PAK，and Rho A signaling network drives actin cytoskeleton dynamics and cell motility switches ［J］. Cell Syst， 2016， 2（1）：38-48.

［2］ Reichman M， Schabdach A， Kumar M， et al. A High-throughput assay for Rho guanine nucleotide exchange factors based on the transcreener GDP assay ［J］. J Biomol Screen， 2015， 20（10）：1294-1299.

［3］ Heasman SJ， Carlin LM， Cox S， et al. Coordinated RhoA signaling at the leading edge and uropod is required for T cell transendothelial migration ［J］. J Cell Bio， 2010， 190（4）：553-563.

［4］ Heasman SJ， Ridley AJ. Multiple roles for Rhoa during T cell transendothelial migration ［J］. Small GTPase， 2010， 1（3）：174-179.

［5］ Pernis AB. Rho GTPase-mediated pathways in mature CD4+T cells ［J］. Autoimmun Rev， 2009， 8（3）：199-203.

［6］ Malinova D， Fritzsche M， Nowosad CR， et al. WASp-dependent actin cytoskeleton stability at the dendritic cell immunological synapse is required for extensive， functional T cell contacts ［J］. J Leukoc Biol， 2016，99（5）：699-710.

［7］ Markey KA， Gartlan KH， Kuns RD， et al. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells ［J］. J Immunol Methods， 2015，423：40-44.

［8］ Xu Y， Pektor S， Balkow S， et al. Dendritic cell motility and T cell activation requires regulation of Rho-cofilin signaling by the Rho-GTPase activating protein myosin IXb ［J］. J Immunol， 2014， 192（8）：3559-3568.

［9］ Zanin-Zhorov A， Waksal SD. ROCKing cytokine secretion balance in human T cells ［J］. Cytokine， 2015， 72（2）：224-225.

［10］ Zanin-Zhorov A， Weiss JM， Nyuydzefe MS， et al. Selective oral ROCK2 inhibitor down-regulates IL-21 and IL-17 secretion in human T cells via STAT3-dependent mechanism ［J］. Proc Nati Acad Sci USA， 2014，111（47）：16814-16819.

［11］ Isgro J， Gupta S， Jacek E， et al. Enhanced rho-associated protein kinase activation in patients with systemic lupus erythematosus ［J］. Arthritis Rheum， 2013， 65（6）：1592-1602.

［12］ Chen Q， Yang W， Gupta S， et al.IRF-4-binding protein inhibits interleukin-17 and interleukin-21 production by controlling the activity of IRF-4 transcription factor ［J］. Immunity， 2008， 29（6）：899-911.

［13］ Wang QM， Liao JK. ROCKs as immunomodulators of stroke ［J］. Expert Opin Ther Targets， 2012， 16（10）：1013-1025.

［14］ Brkic Z， Corneth OB， van Helden-Meeuwsen CG， et al. T-helper 17 cell cytokines and interferon type I： partners in crime in systemic lupus erythematosus？ ［J］. Arthritis Res Ther， 2014， 16（2）：R62.

［15］ Biswas PS， Gupta S， Chang E， et al. Phosphorylation of IRF4 by ROCK2 regulates IL-17 and IL-21 production and the development of autoimmunity in mice ［J］. J Clin Invest， 2010， 120（9）：3280-3295.

［16］ Stirzaker RA， Biswas PS， Gupta S， et al. Administration of fasudil， a ROCK inhibitor， attenuates disease in lupus-prone NZB/WF1 female mice ［J］. Lupus， 2012， 21（6）：656-661.

［17］ Crispin JC， Keenan BT， Finnell MD， et al. Expression of CD44 variant isoforms CD44v3 and CD44v6 is increased on T cells from patients with systemic lupus erythematosus and is correlated with disease activity ［J］. Arthritis Rheum， 2010， 62（5）：1431-1437.

［18］ Rother N， van der Vlag J. Disturbed T Cell signaling and altered Th17 and regulatory T Cell subsets in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus ［J］. Front Immunol， 2015， 30（6）：610.

［19］ Mat MC， Sevim A， Fresko I， et al. Behcet's disease as a systemic disease ［J］. Clin Dermatol， 2014， 32（3）：435-442.

［20］ Oguz E， Alasehirli B， Pehlivan Y， et al. Association between Rho-kinase （ROCK2） gene polymorphisms and Behçet's disease ［J］. Transl Res， 2012，160（6）：428-434.

［21］ Leisegang M， Kammertoens T， Uckert W， et al.Targeting human melanoma neoantigens by T cell receptor gene therapy ［J］. J Clin Invest， 2016，126（3）：854-858.

［22］ Teiti I， Florie B， Pich C， et al. In vivo effects in melanoma of ROCK inhibition-induced fasl overexpression ［J］. Front Oncol， 2015， 145（5）：156.

［23］ Kedziora KM， Leyton-Puig D， Argenzio E， et al. Rapid remodeling of invadosomes by Gi-coupled receptors： DISSECTING THE ROLE OF Rho GTPases ［J］. J Biol Chem， 2016， 291（9）：4323-4333.

［24］ Gandham VD， Maddala RL， Rao V， et al. Effects of Y27632 on keratinocyte procurement and wound healing ［J］. Clin Exp Dermatol， 2013，38（7）：782-786.

［25］ Piltti J， Varjosalo M， Qu C， et al. Rho-kinase inhibitor Y-27632 increases cellular proliferation and migration in human foreskin fibroblast cells ［J］. Proteomics， 2015， 15（17）：2953-2965.

［26］ Bond JE， Kokosis G， Ren L， et al. Wound vontraction is attenuated by fasudil inhibition of Rho-associated kinase ［J］. Plast Reconstr Surg， 2011，128（5）：438e-450e.

Advances in the research of immunoregulation of Rho GTPase/ROCK signaling pathway in dermatosis

ZHANG Li-ping，HE Yan-ling
Department of Dermatology， Beijing Chao-yang Hospital Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100020， China

In the immunoregulation of skin vasculitis and dermatoma， the effect of Rho GTPase/ROCK signaling pathway is receiving more attentions in view of its moderating role on T cells. The pathway mainly affects cytoskeletal rearrangement and cell movement. Recent studies have indicated that Rho GTPase/ROCK pathway can influence the adhesion， migration， stimulation and activation of T cells， and affect the immune response. Rho GTPase/ROCK pathway is involved in the pathogenesis of system lupus erythematosus， Behcet's disease and melanoma. Currently， Y27632 and Fasudil， the inhibitors of Rho GTPase/ROCK signaling pathway， have been put into clinical and basic research， which have achieved good results and may be the potential drugs in the treatment of the disease in the future. More and more evidences show that ROCK inhibitors play an important role in wound healing and scar contracture in recent years.

Rho GTPase/ROCK signal pathway；T cell；Vasculitis，dermal；Melanoma

R318

A

1674-1293（2016）04-0259-03

2016-04-16

2016-05-24）

（本文编辑 敖俊红）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160411

北京市科委（Z151100003915129）

100020 北京，首都医科大学附属北京朝阳医院（张利平，何焱玲）

张利平，硕士研究生，住院医师，研究方向：皮肤血管炎，E-mail： zlp2015zlp@163.com

何焱玲，E-mail： heyldoc@163.com