高山被孢霉中Δ6脱饱和酶关键位点及其对活性的影响

史海粟，陈海琴，顾震南，张灏，陈永泉，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)



高山被孢霉中Δ6脱饱和酶关键位点及其对活性的影响

史海粟，陈海琴*，顾震南，张灏，陈永泉，陈卫

(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122)

高山被孢霉中Δ6脱饱和酶(MaFADS6)是决定ω3/ω6多不饱和脂肪酸代谢流的关键酶。利用定点突变技术研究MaFADS6-Ι一级结构与功能的关系，为高山被孢霉多不饱和脂肪酸的合成提供了理论依据。利用非链取代式质粒扩增技术对已构建质粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι内的表达单元(即MaFADS6-Ι)中细胞色素b5区(HPGG)下游的位点进行定点突变，将所有突变体分别转化酿酒酵母进行诱导表达，进一步通过在培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察重组菌对各底物的催化作用。实验结果表明，所有突变体催化α-亚麻酸(ALA)的活性没有改变；K61和D68两个位点对催化亚油酸(LA)起关键作用，其对应的4个突变体对LA的转化率分别为(6.2±0.5)% (K61T)、(0.3±0.0)% (K61F)、(8.2±0.7)% (D68N)和(6.6±0.8)% (D68L)，相比原始转化率各降低50%以上；G63和T69两个位点对LA的催化无直接影响，但G63T突变体由于突变位点极性改变，其对LA的转化率为(8.5±0.9)%，比原始转化率降低了49.9%；而V66位点的突变体对LA的转化率分别为(22.3±2.6)% (V66T)和(20.7±2.5)% (V66A)，比原始转化率分别降低了36.1%和37.8%。确定了MaFADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68两个关键氨基酸位点经突变后均会使其酶活明显降低，这为研究MaFADS6-Ι一级结构与功能的关系提供了理论依据。

Δ6脱饱和酶；高山被孢霉；定点突变

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对人体有重要的生理功能，对人类膳食和健康具有重要意义[1]。目前PUFAs的动植物来源有限，而利用产脂微生物合成PUFAs成为当今研究热点。高山被孢霉(Mortierellaalpina)是目前工业化生产花生四烯酸(arachidonic acid, 20:4Δ5,8,11,14, AA)的主要菌株，也是少量合成二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid, 20:5Δ5,8,11,14,17, EPA)的具有正式安全性评估的菌种，同时也是脂质生物化学基础研究的重要模式菌[2-7]。

在高山被孢霉合成PUFAs途径中(图1)，Δ6脱饱和酶是调控ω3/ω6脂肪酸代谢流的“分子开关”，它可以将α-亚麻酸(α-linolenic acid, 18:3Δ9,12,15, ALA)转化为十八碳四烯酸(stearidonic acid, 18:4Δ6,9,12,15, SDA)或将亚油酸(linoleic acid, 18:2Δ9,12, LA)转化为γ-亚麻酸(γ-linolenic acid, 18:3Δ6,9,12, GLA)[8-9]。高山被孢霉中Δ6脱饱和酶(MaFADS6)对这两种底物的选择性决定了ω3/ω6的比例，因此研究Δ6脱饱和酶的结构与功能的关系具有重要意义，但该酶是一个膜结合脱饱和酶，其分子结构与功能关系的研究一直没有取得重要进展。现阶段主要利用蛋白质功能区域交换或定点突变的技术进行研究。本实验室已对高山被孢霉ATCC 32222的Δ6I-脱饱和酶进行了催化特性的研究，确定了其底物偏好相关的关键位点[10]，但对其细胞色素b5区域和His I区之间的氨基酸片段还没进行详细研究，本文将依托氨基酸多序列比对，对Δ6脱饱和酶的氨基酸序列进行比较，确定了细胞色素b5的特征结合区域-HPGG(His-Pro-Gly-Gly)下游的位点进行定点突变，旨在获得影响高山被孢霉来源MaFADS6-Ι催化特性的关键位点，为研究产脂微生物M.alpina中ω3/ω6脂肪酸流向调控提供理论基础。

图1　高山被孢霉中多不饱和脂肪酸合成途径PUFAs biosynthetic pathways of M.alpina

1　材料与方法

1.1菌株和质粒、培养基

大肠杆菌(Escherichiacoli) TOP 10为实验室菌种库提供；高山被孢霉ATCC 32222购于美国标准生物品收藏中心，由本实验室菌种库保藏，并已对其完成基因组测序；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)营养缺陷型INVSc1及表达载体质粒pYES2/NT C购自INVITROGEN公司，由本实验室保藏。YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖。LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。SC-U及诱导培养基见pYES2/NT C操作手册。胰蛋白胨和酵母提取物均购自Oxoid公司。

1.2工具酶和试剂

游离脂肪酸LA和ALA及脂肪酸标品购于NU-CHEK，PREP公司。DNA marker DL10000购自TAKARA公司； HYQspinTMPlasmid DNA Kit柱式法质粒小提试剂盒(HG101-01)购自HYQBio公司；DNA序列测试也由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；快速定点突变试剂盒购于TIANGEN公司；一抗(6×His标签鼠抗，Mouse THETM His Tag Antibody)和二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，HRP-conjugated Goat Anti Mouse IgG)购于Genscript公司；引物由上海桑尼有限公司合成。其他常规试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.3实验方法

1.3.1同源序列比对及拓扑模型预测

将MaFADS6-Ι与其他10个物种的Δ6脱饱和酶的氨基酸序列在DNAMAN软件中进行比对，并在TMHMM上完成对MaFADS6-Ι拓扑模型的预测。

1.3.2MaFADS6-Ι定点突变及测序鉴定

MaFADS6-Ι基因定点突变方法采用非链取代式质粒扩增技术，根据部分重叠的引物设计原则，利用primer5.0引物设计软件，设计K61T、K61F、G63A、G63T、V66T、V66A、D68N、D68L、T69V、T69S十对含预定突变位点的互补的寡核苷酸引物，送上海桑尼有限公司合成，如表1所示。以实验室前期构建的pYES2-MaFADS6-Ι质粒为模板，按TIANGEN公司快速定点突变试剂盒的操作说明进行定点突变的载体构建实验(图2)。

表1　本文所用的引物

注：a下划线代表突变的碱基位点。

图2　表达载体pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的构建图示Fig.2　Schematic map of the recombinant plasmid pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)

对长出的突变克隆子进行PCR鉴定后,送交生工生物工程(上海)股份有限公司测序。得到的相应序列与MaFADS6-Ι基因原始序列使用Clustal X 2.1软件进行分析比较。将突变正确的转化子于-80 ℃冰箱在甘油管里保存。

1.3.3重组质粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的转化

接种酿酒酵母菌株INVSc1的单菌落于YPD液体培养基，28 ℃恒温摇床过夜培养，接种适量的过夜培养液至YPAD液体培养基，28 ℃摇床过夜培养后离心收集菌体。细胞用无菌水和锂盐溶液[10×TE缓冲液∶10×LiAcV(贮液)∶V(无菌水)=1∶1∶8]各重悬1次，1 mL/份分装，于-80 ℃保存。

取200 μg载体DNA(鲑鱼精DNA)和≤5 μg重组表达载体一起加入2 mL EP管，混匀，加入锂盐溶液重悬，再加入1mL新鲜PEG溶液(50% PEG溶液∶10×TE缓冲液∶10×LiAc贮液=8∶1∶1)，30 ℃摇荡温育30 min后于42 ℃热休克15 min，取200 μL 1×TE缓冲液重悬，最后取其中少量涂布于SC-U平板，28 ℃培养36～48 h。转化子经PCR验证后，于-80 ℃甘油管保存。具体方法详见精编分子生物学实验指南[11]。

1.3.4重组质粒pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的表达及产物的Western blot分析

挑取酵母转化子单菌落至SC-U液体培养基，28 ℃摇床培养48 h，测定OD600值，取适量菌液接入含15 mL SC-U液体培养基的三角瓶，28 ℃摇床培养48 h，收集菌体，ddH2O重悬3次，SC-U诱导培养基重悬1次，离心去上清，加入15 mL SC-U诱导培养基，28 ℃摇床诱导12 h后收菌。

取2 mL诱导后的培养液，离心去上清，加入160 μL酵母破壁缓冲液和等体积的玻璃珠，使用FastPrep快速细胞破碎仪破壁后，加入40 μL 5×Loading Buffer，沸水浴5～10 min，取10 μL上样。样品经SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜，TBST溶液漂洗3次，5 min/次，以含5%脱脂奶粉的TBST溶液于4 ℃缓慢振摇45 min，TBST溶液漂洗3次，5 min/次， 按1∶5 000加入6× His标签的鼠抗，孵育1 h，回收一抗，TBST溶液漂洗3次，5 min/次，按1∶2 000 加入HRP标记的羊抗兔IgG，缓慢摇荡45 min，TBST溶液漂洗3次，5 min/次。取等体积A、B液(A液：0.01 mol/L鲁米诺溶液；B液：0.1 mol/L双氧水溶液)混合，将PVDF膜反贴于A、B混合液于FluorChem FC3成像仪观察。

1.3.5重组Δ6脱饱和酶的活性测定

在上述诱导后的培养基中加入0.25 mmol/L cis-LA和0.25 mmol/L cis-ALA，28 ℃摇床继续培养12 h后收菌。菌体水洗3次，冻干。取100 mg冻干菌体，加2 mL 6mol/L的HCl，80 ℃水浴3 h，恢复至室温，加1 mL甲醇，振荡，加2 mL三氯甲烷，振荡1 min，收集氯仿层，氮气吹干；加入2 mL 10%的盐酸甲醇，60 ℃水浴3 h，加入1 mL饱和氯化钠和2 mL正己烷混匀，取上层于GC瓶。通过气相色谱仪对脂肪酸甲酯进行定性及定量分析，具体方法参照文献[12]。

1.3.6三维结构模拟

Δ6脱饱和酶各突变位点及突变体的三维结构通过SWISS-MODEL软件完成模拟，通过在线数据库自动搜索匹配的模板进行比对，生成三维结构。

2　结果与讨论

2.1同源序列比对及突变位点确定

利用DNAMAN软件对不同来源的Δ6脱饱和酶的氨基酸序列进行比对，如图3所示，发现MaFADS6-Ι与其他Δ6脱饱和酶一样，含有细胞色素b5区HPGG及3个组氨酸保守区即Ⅰ区HX3H、Ⅱ区HX2HH、Ⅲ区QX2HHLFP。细胞色素b5区域是作为Δ6脱饱和酶催化时的电子供体，该结构域中的HPGG是一个非常保守的亚铁血红素结合基序，是前端脱饱和酶的显著特征，对脂肪酸的脱饱和起着关键作用[13-14]。因此，我们从该区域寻找可能与Δ6脱饱和酶催化特性相关的位点，并在细胞色素b5区下游发现有一段比较保守的区域，其中有5个氨基酸位点存在差异，这可能与不同来源的Δ6脱饱和酶的催化特性相关。

MaFADS6-Ι：高山被孢霉ATCC 32222；OmFADS6：大麻哈鱼；CoFADS6：耳霉；TpFADS6：海链藻；GcFADS6：球状金藻；PtFADS6：三角褐指藻；PiFADS6：缺刻缘绿藻；CpFADS6：角齿藓；PyiFADS6：畸雌腐霉；MfFADS6：高山被孢霉1S-4；MWFADS6：高山被孢霉W15细胞色素b5(HPGG)区域用下划线表示，星号表示相同的氨基酸残基，箭头指示的氨基酸残基表示定点突变的位点。图3　基于Clustal X软件的FADS6序列比对Fig.3　Multiple Sequence alignment of FADS6 by Clustal X

通过脂肪酸脱饱和酶拓扑学模型分析显示，3个组氨酸保守区全部位于Δ6脱饱和酶的亲水区域。用TMHMM软件对Δ6 脱饱和酶的氨基酸序列的二级结构进行疏水性分析，拓扑结构如图4所示，该基因具有Δ6脱饱和酶基因的典型结构特征，两个长的跨膜疏水区，3个组氨酸保守区全部位于亲水区一侧，2个疏水的跨膜区穿过膜4次，与3个组氨酸保守区组成Δ6脱饱和酶的催化中心，5个待突变的氨基酸位点位于胞浆内。

图4　Δ6脱饱和酶的拓扑模型结构Fig.4　The predicted topology model of FADS6

2.2突变体构建及其验证

以氨基酸的亲水性和疏水性为原则，将5个位点的氨基酸残基分别突变成亲水性氨基酸和疏水性氨基酸。以提取的重组质粒pYES2-MaFADS6为模板，由表1的突变引物进行非链取代式质粒PCR扩增，经DpnI消化后转化至FDM感受态细胞中(定点突变试剂盒提供)，待长出单菌落后进行PCR验证，结果如图5所示，扩增出的Δ6脱饱和酶突变基因大小在1 500 bp左右，与理论值大小一致。将鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，确证定点突变成功。

M-Marker; 1,2-pYES2-K61T; 3,4-pYES2-G63A; 5,6-pYES2-V66T; 7,8-pYES2-D68N; 9,10-pYES2-T69V; 11,12-pYES2-K61F; 13,14-pYES2-G63T; 15,16-pYES2-V66A; 17,18-pYES2-D68L; 19,20-pYES2-T69S; 21-pYES2-FADS6图5　Δ6脱饱和酶突变基因重组载体pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)的PCR验证Fig.5　Identification of recombinant vectors for mutant genes by PCR

2.3MaFADS6-Ι突变基因在酿酒酵母中的表达

重组载体pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutantsites)转化酿酒酵母并诱导后，经SDS-PAGE分析和Western blot分析显示，重组MaFADS6-Ι在相对分子质量约54 kDa处可见特异的蛋白条带，与理论分子量一致，且各转化子的蛋白表达量在同一水平(图6)。

MW-Marker；1-pYES2/NT C；2-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61T；3-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61F；4-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63A；5-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63T；6-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66T；7-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66A；8-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68N；9-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68L；10-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69V；11-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69S；12-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι图6　各突变基因表达产物的SDS-PAGE和Western bolt分析Fig.6　Analysis of expressing products by SDS-PAGE and Western bolt

2.4重组MaFADS6-Ι的催化特性分析

为验证重组MaFADS6-Ι的催化特性，选取已诱导的酵母转化子，以原始MaFADS6-Ι为对照，加入LA和ALA底物，28 ℃摇床培养12 h后通过气相色谱确定样品中LA、GLA、ALA和SDA的百分含量，以计算其对不同底物的转化率。结果如图7和图8所示，原始MaFADS6-Ι对LA和ALA的活性分别为56.2%和2.9%，所有重组MaFADS6-Ι对ALA的催化活性无影响。在对LA催化活性的影响上，K61T和K61F突变体对LA的转化率相比比原始MaFADS6-Ι有明显降低，分别降为6.2%和0.3%，这说明K61位点在MaFADS6-Ι的结构和功能中起重要作用，而将该点的Lys(K)突变成Phe(F)之后，几乎检测不到活性，推测原因可能是由于Phe的结构中存在苯环，其空间位阻使底物LA不能与酶契合；G63A、T69V和T69S对LA的转化率没有显著影响(分别为50.6%、51.8%和45.5%)，但将G63突变成Thr时，转化率却降低至8.5%，由于Ala是非极性R基氨基酸，而Thr是不带电荷的极性R基氨基酸，这种替换改变了该位点的极性，从而破坏了MaFADS6-Ι活性中心的正常三维结构导致活性下降；V66T和V66A对LA的转化率分别为22.3%和20.7%，比原始MaFADS6-Ι的活性降低了50%以上， 推测该位点对酶活有影响，但不是影响酶活最关键的位点；D68N和D68L对LA的转化率分别为8.2%和6.6%，推断D68位点对MaFADS6-Ι活性的影响比V66位点更重要。

图7　同时添加底物LA和ALA时各突变体对底物的转化率Fig.7　Conversion rate of each mutant for each substrate其中LA转化率(%)=100 ×反应生成的GLA的量/(反应生成的GLA的量+反应剩余的LA的量)，ALA转化率(%)=100 ×反应生成的SDA的量/(反应生成的SDA的量+反应剩余的ALA的量)。

2.5三维结构模拟分析

为了直观地解释各突变体的活性验证结果，以最近WANG[15]和BAI[16]等人在Nature杂志发表的人类和动物的Δ9-脱饱和酶的晶体结构和昆虫细胞色素b5区域的结构[17]为模板，利用SWISS-MODEL软件模拟出MaFADS6-Ι的三维结构(图9)，各突变体的三维结构模拟图显示，对K61和D68两个氨基酸位点进行突变后，其三维结构发生了明显变化，而其他3个位点(G63、V66和T69)的突变没有引起明显的结构改变，这与酿酒酵母活性验证结果吻合。

综上所述，K61和D68两个位点对MaFADS6-Ι的活性起关键作用，G63和T69 两个位点对MaFADS6-Ι的活性不起关键作用，V66位点对MaFADS6-Ι的活性介于上述两者之间。

a-Cells of control(pYES2/NT C)；b-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι；c-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61T；d-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-K61F；e-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63A；f-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-G63T；g-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66T；h-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-V66A；i-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68N；j-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-D68L；k-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69V；l-pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-T69S图8　同时添加底物LA和ALA后各重组载体pYES2/NT C-MaFADS6-Ι-(mutant sites)脂肪酸组成的GC图谱Fig.8　GC of fatty acids in each recombinants by adding both LA and ALA substrates

图9　突变体的三维结构模拟图Fig.9　Three-dimensional structure of each mutant(其中灰色结构表示突变氨基酸的化学结构式)

3　结论

本研究以MaFADS6-Ι为研究对象，通过序列分析确定了关键位点，对其进行突变后测定各突变体对两底物的催化作用，最终确定了MaFADS6-Ι氨基酸序列中K61和D68两个关键氨基酸位点对其催化活性有重要影响。

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Key sites of Δ6 desaturase fromMortierellaalpinaand its effect on catalytic activities

SHI Hai-su, CHEN Hai-qin*, GU Zhen-nan, ZHANG Hao,CHEN Yong-quan, CHEN Wei

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Δ6 desaturase from oleaginousMortierellaalpina(MaFADS6) is a key enzyme in biosynthesis of ω3/ω6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs). This study focused on the relationship between the primary structure and function for MaFADS6-Ι based on site-directed mutagenesis. Non-chain plasmid amplification method was used in this study to target downstream of cytochrome b5 region (HPGG) in the expression unit (MaFADS6-Ι) of pYES2/NT C-MaFADS6-Ιby site-directed mutagenesis. Each recombinant plasmid was transformed and expressed inSaccharomycescerevisiae. The results showed that the catalytic activity of all mutant using α- linolenic acid (ALA) as substrate has not changed. Two catalytic sites, K61 and D68, played a key role for its catalysis on linoleic acid (LA). The LA conversion rate of four corresponding mutants was (6.2 ± 0.5)% (K61T), (0.3 ± 0.0)% (K61F), (8.2 ± 0.7)% (D68N) and (6.6 ± 0.8)% (D68L), respectively, which reduced by more than 50% compared to the original conversion rate. G63 and T69 were two sites which not directly affect the catalysis of LA, but LA conversion of G63T mutant was (8.5 ± 0.9)% which decreased 49.9% compared the original conversion rate due to polarity change of mutation site. LA conversion rates of V66 mutants were (22.3 ± 2.6)% (V66T) and (20.7 ± 2.5)% (V66A), which decreased by 36.1% and 37.8% compared to the original conversion rate. Enzymatic activities were significantly reduced after mutation of two key site of amino acid sequence of MaFADS6-Ι, K61 and D68. It provided a theoretical basis for the study on relationship between primary structure of MaFADS6-Ιand its function.

Δ6 desaturase;Mortierellaalpina; site-directed mutagenesis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201609001

硕士研究生(陈海琴教授为通讯作者,E-mail：haiqinchen@jiangnan.edu.cn)。

国家自然科学基金(No.21276108)

2016-02-03，改回日期：2016-03-21