耐超高温α-淀粉酶的研制

李谢晟（高二学生，项目研究者）张四槐（项目指导教师）

耐超高温α-淀粉酶的研制

对射线处理后的地衣芽孢杆菌进行筛选，获得一株能耐100℃高温的菌株。对菌株产生的酶进行酶学性质研究表明，该酶在100℃下，酶活力是27500u/mL，耐高温性和酶活力指标均超过国家标准。进行产酶发酵中试和超滤、盐析提取实验，结果是超滤法比盐析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低20%。酶制剂在酶活力、热稳定性优于国家优等品标准，具有实用价值。

下文介绍该项目研制的过程。

一、材料与方法

（一）实验材料和药品

1.菌株

地衣芽孢杆菌（B.licheniformis），由湖南农大提供。

2.培养［1］

（1）琼脂平板培养基。培养基配方∶胰蛋白胨1.5g，酵母膏0.7g，NaCl1.0g，琼脂2.0g，可溶性淀粉1.0g，pH值7.0，其余为水，合计总重100g。上述100g配料混匀后分放于培养皿，0.1MPa灭菌30-35min，冷却到室温，制成琼脂复壮培养基备用。

（2）基础培养基。不加琼脂，其他与琼脂平板培养基相同。

（3）筛选培养基：在基础培养基上加入2%琼脂和0.01%曲利本蓝。

（4）扩大培养基配方：胰蛋白胨1.0-1.5%，酵母膏0.5-0.7%，NaCl0.9-1.1%，可溶性淀粉1%，pH值6.5-7.0，其余为水，合计总重5kg，0.1MPa灭菌30-35min，冷却到40℃，制成扩大培养基，备用。

（5）液态发酵培养基配方：（NH4）2SO40.22-0.27%，KH2PO40.30-0.37%，CaCl20.015-0.02%，可溶性淀粉0.25-0.30%，胰蛋白胨0.35-0.45%，玉米粉2.9-3.5%，pH值6.5-7.0，其余为水，合计总重50kg，0.1MPa灭菌30-35min，冷却到40℃，制成液态发酵培养基，备用。

3.主要试剂、材料

硅藻土，原碘液，稀碘液［2］，磺化聚砜∶超微滤膜（型号YM-200），20g/L可溶性淀粉溶液，磷酸缓冲液，NaOH溶液（0.5mol/L），盐酸溶液（0.1mol/L）。曲利本蓝。

4.主要仪器

板框压滤机，Unic7200型可见分光光度计，PL303型电子天平，HH-6型恒温水浴锅，电子万用炉，PHS-3C型pH计，离心机，XK96-B型快速混匀器，高压消毒器，超净工作台，培养箱，恒温箱。

（二）实验方法

1.菌株筛选、分离

取活化培养的地衣芽孢杆菌，加入装有45mL无菌水的小三角瓶中，取0.1mL梯度稀释（10-5、10-4、10-3）涂布到筛选平板上，37℃±1℃培养60h，测量D/d（水解圈直径/菌落直径）值，挑选出比值较大的保存。

之后，将筛选得到的菌纯化后进行液体培养。培养60h，取培养液离心后收集上清液，经超滤浓缩得到酶液，在100℃下进行α-淀粉酶活性测定，选取酶活高的菌株进行传代培养。

2.产酶发酵

（1）基础培养：取平板培养后的地衣芽孢杆菌，接种于100mL基础培养基中，180r/min、36℃±1℃恒温培养40h。

（2）扩大培养：取步聚（1）制成的琼脂培养基菌种，按扩大培养基重0.8%的接种量，接种到冷却到40℃的扩大培养基，36℃±1℃恒温培养60-70小时。恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升培养基/分钟，制成扩大培养液。

（3）液态发酵培养：取（2）步聚的扩大培养液，按液态发酵培养基重2.5-3.5%的接种量，接种到冷却到40℃的液态发酵培养基中，36℃±1℃恒温培养60-70小时。恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-350转/分钟，通风量为1.3-1.5立方气体/升培养基/分钟，制成液态发酵液。

2.淀粉酶活力的测定

国标法——分光光度计法［2］

方法步骤：吸取可溶性淀粉溶液20.00mL于各具塞试管中→加入缓冲液5.00mL摇匀→控温5min→加入稀释好的待测酶液1.00mL→计时、摇匀、准确反应5min→吸取反应液1.00mL→加稀碘液5.00mL，摇匀→稀碘液作空白，于波长660nm处迅速测定吸光度。

根据其吸光度查表Al，求得测试酶液的浓度（c），再计算酶活力。

X=c×n×16.67。（式中：X—样品的酶活力（u/mL），c—测试酶的浓度，n—样品的稀释倍数，16.67—换算常数）

3.α-淀粉酶最适温度的测定：在磷酸缓冲液（pH值6.0）的反应体系中［2］，将反应温度分别控制在50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃下，分别用1%淀粉溶液作为底物进行酶催化反应，测量酶活力［2］。

4.α-淀粉酶热稳定性的测定［3］：取适量酶液（添加或不添加Ca2+）分别在不同温度（70℃、80℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃和115℃）下保温1h后，迅速置于4℃冰箱内降温，然后统一在标准条件下测定残余酶活，以未处理的酶液的酶活设为100%。

5.α-淀粉酶最适pH值的测定［2］：配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的醋酸盐缓冲液和pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5的Tris-HCl缓冲液，通过改变反应体系的pH值，测定不同pH值下酶活力大小。

6.α-淀粉酶的提取、纯化。

（1）方法1：板框压滤→酶的超滤浓缩及精制。

粗滤：往上述发酵好的液态发酵液中添加液态发酵液重4-6%的硅藻土，混合均匀后装入板框压滤机，以0.6兆帕压力压滤，实现固液分离，收集酶的滤液。工作原理是依靠压紧装置将滤板压紧，再将悬浮液用泵压入滤室，通过滤布来达到将固体颗粒和液体分离的目的。

酶的超滤浓缩及精制［4］：酶的滤液中含有许多无机盐、糖和氨基酸之类的低分子物质，它们对酶制剂的颜色、气味、酶含量等都有很大的影响。α-淀粉酶的分子质量在10000Da-100000Da之间，这个范围恰好在超滤技术应用的范围之内。采用超滤技术过滤粗酶液，低分子物质和盐类可以与水一起经膜孔除去，而酶被浓缩和精制。以微滤膜（磺化聚砜）将步聚4粗滤液过滤浓缩5倍，浓缩液以塑料桶装，在室温（5-25℃）温度下保存即可。

（2）方法2：酶的盐析法浓缩及精制［3］。技术路线：离心→硫酸铵盐析→透析、除盐。具体操作：将发酵液进行离心（40℃，8000r/min，30min），收集上清液取→取上清液，经40%硫酸铵盐析，4℃静置4h，离心（40℃，9000r/min，30min）取上清夜→以80%硫酸铵盐析，4℃静置过夜，离心（40℃，10000r/min，30min）收集沉淀→用少量蒸馏水溶解沉淀，通过透析方法除盐。

二、结果与分析

1.菌株筛选、分离结果

用选择平板进行初筛，以水解圈大小为指标，初筛到5个菌落（分别标号为：ABCDE）对这五个菌落进行3次划线分离、纯化。

把A、B、C、D、E菌分别进行液体培养，收集酶液，在100℃下测α-淀粉酶活性，C、D菌株产生的α-淀粉酶在100℃下有活性，其中D菌株较高，为27500u/mL。

2.酶的作用温度

实验测定温度对α-淀粉酶活性影响的结果如表1。

温度℃70℃80℃85℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃酶活力（u/mL）7000 11000 14800 19500 23000 27500 28300 22500 11000

数据表明，菌株产生的α-淀粉酶在pH值为6.0时，酶作用的最适温度为105℃左右。105℃时，酶活力为28300u/mL。在110℃仍有81%的酶活力，以国家标准2000u/mL考虑，适宜温度范围92-110℃。从70℃到105℃，随温度升高，活性增长；超过105℃，酶活性随温度升高而降低。

3.酶的热稳定性

酶的热稳定性实验结果如表2。

温度70℃80℃90℃95℃100℃105℃110℃115℃对照组相对酶活力100% 100% 100% 100% 100% 95% 80% 40% 100%

数据表明在最适温度105℃下处理1小时后，酶耐热性存活率95%，100℃以下酶耐热性存活率100%。国家标准［2］为：酶耐热性存活率95℃，60min大于或等于95%。说明此α-淀粉酶热稳定性好，高于国家标准。

4.反应pH值对酶活性的影响

表3反应pH值对酶活性的影响

从表3可以看出，该酶的最适pH值为5.5左右，在pH值5.0-6.5之间，酶活性在80%以上，是一种适合偏酸型的α-淀粉酶。pH值在4.0-5.5时，随pH值升高，酶活性增强。超过5.5，随PH值升高，酶活性降低。

5.α-淀粉酶的提取、纯化

发酵液经两种提取、纯化方法分别得到发酵上清液、硫酸铵沉淀纯化液，板框压滤液、超滤纯化液，对上述四种提取物进行酶活、回收率、纯化倍数进行测定和计算

两种分离纯化结果如表4。

表4α-淀粉酶分离纯化

进行统计分析，方法1与方法2相比，P＜0.01，差异显著。数据表明，超滤法比盐析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，说明超滤法比盐析法在收到的酶数量、酶活性高，且差异显著。超滤法提取成本低20%。

三、讨论

淀粉的水解过程通常包括两步：液化和糖化。在液化阶段，淀粉颗粒在喷射罐105-110℃经过5min的高温喷射糊化成液状。如果糊化温度低于105℃，则淀粉糊化不完全，将影响后续的过滤过程。但目前使用的α-淀粉酶最适作用条件为90℃，在温度高于100℃时，会使酶失活。因此耐超高温α-淀粉酶成为目前研究的热点。本研究用地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）发酵产生的耐超高温α-淀粉酶最适温度为105℃，在110℃仍有81%的酶活力且酶活力超过国家标准，适合理想的液化条件。酶活力为28300u/mL，比国家标准20000提高了41%，催化效率高，降低生产成本，因此该酶有实用价值。

酶制剂的传统生产工艺是发酵、絮凝沉淀、过滤、溶剂萃取、真空蒸发、干燥，其生产过程能耗高、酶失活率高、收率低。膜分离技术具有节约能源、降低损耗、可在常温下连续操作、过程简单、高效、无相变、分离系数较大等优点［5］。实验数据表明，对于α-淀粉酶的提取，超滤法比盐析法回收率高12.5%，酶的比活力高45.9%，成本低，说明超滤法适合α-淀粉酶的分离、提纯。

此酶制剂符合国标，是一种应用广的α-淀粉酶制剂，具有应用推广价值。

（作者单位：娄底市第三中学娄底市第五中学）

［1］陈晨．耐高温α-淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因的克隆．2009中南大学硕士论文

［2］中华人民共和国轻工行业标准QB/T2306 -1997，耐高温α-淀粉酶制剂．

［3］王淑军、陆兆新、秦松等．超嗜热古菌耐热酸性α-淀粉酶的发酵条件和酶学性质研究［J］，海洋与湖沼，2009年1月．

［4］李香莉，吕莉萍，肖凯军．膜分离技术在酶制剂工业中的应用［J］．食品研究与开发．

［5］石方方，焦国宝，丁长河，屈建航，屈凌波，刘仲敏．耐酸耐高温α－淀粉酶的研究进展［J］．中国食品添加剂，2014年第4期．