骨髓瘤细胞系β-连环素表达水平及其对硼替佐米敏感性的影响

冯　遥　夏　勇　李　磊　徐少珊

(广州医科大学附属第三医院检验科，广东 广州 510150)



·论著·

骨髓瘤细胞系β-连环素表达水平及其对硼替佐米敏感性的影响

冯遥*夏勇李磊徐少珊

(广州医科大学附属第三医院检验科，广东 广州 510150)

目的:研究β-连环素(β-catenin)在骨髓瘤细胞系中的表达情况及其对硼替佐米敏感性的影响。方法:分别培养3种骨髓瘤细胞系，qRT-PCR检测各细胞系中β-catenin表达情况；利用慢病毒转染技术构建过表达β-catenin细胞系(过表达组)，同时设立空白质粒对照组；采用CCK-8检测硼替佐米对细胞活性的影响。结果：RPMI8226细胞系中β-catenin表达水平最高，明显高于NCI-H929细胞系(P<0.05)；过表达组β-catenin蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)；过表达组细胞活性明显高于对照组(P<0.05)。结论：在骨髓瘤细胞系NCI-H929中过表达β-catenin时，可能降低细胞对硼替佐米的敏感性。

骨髓瘤细胞；硼替佐米；β-连环素

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞克隆增殖性疾病，好发于60岁以上老年人，是常见的血液系统恶性肿瘤[1]。硼替佐米能显著提高MM的临床疗效，当其与化疗及自体造血干细胞移植联合应用时，能使患者的中位生存时间增加至5～7年[2]。然而，对硼替佐米原发或继发耐药的发生是导致难治的根本原因[3]，因此寻找能影响骨髓瘤细胞对硼替佐米敏感性的生物因子具有重要的意义。β-连环素(β-catenin)作为一种细胞骨架蛋白，已被证实在肝癌、喉癌、结直肠癌、骨髓瘤等多种肿瘤中存在异常表达[4-5]，本研究将就β-catenin在骨髓瘤细胞中的表达情况及其是否会影响细胞对硼替佐米敏感性进行探讨。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系骨髓瘤细胞系NCI-H929、CZ-1、RPMI8226均用RPMI(含10%胎牛血清，1%青霉素和1%链霉素双抗)培养基培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。

1.1.2主要试剂胎牛血清和RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Lopofectamine 2000、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；β-catenin兔源性多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；β-actin单克隆抗体购自武汉博士德公司；羊抗兔及羊抗鼠二抗、ECL、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司。GADPH内参及β-连环素引物套装购自广州Life 公司；Takara逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；荧光定量检测试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；CCK-8购自上海碧云天公司；硼替佐米(国药准字J20100108)购自美国Ben Venue Laboratories Inc；慢病毒载体为pSin-puro载体、病毒上清液、Puromycin及Polybrene，由上海吉凯基因公司提供。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR检测各细胞系中β-catenin的表达用Trizol Reagent提取试剂提取细胞中的总RNA，将其反转录成cDNA后，采用β-catenin逆转录特异性引物构建反转录体系，以GADPH为内参照。PCR的反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s，共33个循环，72 ℃ 8 min。采用2- CT法来比较β-连环素的相对表达。CT值为阈值对应的循环数，可用于检测β-catenin及GAPDH的拷贝数目。CT值越高，则β-catenin及GAPDH的拷贝数目越低。

1.2.2构建过表达β-catenin细胞系由上海吉凯基因公司完成pSin-β-catenin慢病毒载体的合成与包装，收集病毒上清液，并设立pSin/neo空白质粒对照组，即vector组；将NCI-H929细胞以30%的密度铺入6孔板中，培养24 h后，将已经收集好的病毒上清液(β-catenin组和vector组)分别加入6孔板的两个孔中，同时加入8 μg/mL的Polybrene，以提高病毒的感染效率；阳性细胞筛选：病毒感染12 h后，更换新鲜培养基并继续培养48 h，而后加入含有1 μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)的RPMI培养基，继续培养1～2周，中途每隔2天更换1次培养基；稳定系的鉴定：将经嘌呤霉素筛选过的细胞，分别提取总蛋白，通过western blotting检测β-catenin是否被成功过表达。

1.2.3Western blotting检测β-catenin表达取对数生长期细胞，加100 μL细胞裂解液于4 ℃裂解细胞30 min，12 000 rpm离心10 min，取上清液，通过BCA试剂盒测分别检测两组细胞NCI-H929细胞的总蛋白浓度。按照每泳道50 μg总蛋白进行12% SDS-PAGE，将蛋白质电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜上，加5%脱脂奶于室温封闭2 h后，分别加入1∶200 稀释的兔抗人β-catenin、鼠抗人β-actin单克隆抗体，于4 ℃培育过夜；洗膜后分别加入1∶1 000稀释的二抗稀释液，室温2 h；用ECL化学发光试剂显色，然后进行检测。计算各条带的积分光密度值，以目的条带的积分光密度值与对应内参照β-actin的积分光密度值之比作为β-catenin的相对表达量。

1.2.4CCK-8检测设立5个不同药物浓度的硼替佐米处理NCI-H929-β-catenin和NCI-H929-vector组，药物浓度梯度设为0 μg/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、160 ng/mL，分别处理两种细胞24 h之后进行CCK-8检测，具体步骤参照说明书。

1.3统计学方法

2　结　果

2.1β-catenin在各骨髓瘤细胞系中表达水平比较

3种骨髓瘤细胞系中β-catenin表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，其中在RPMI8226细胞系中最高，在NCI-H929中最低，见表1。

表1　β-catenin在各骨髓瘤细胞系中表达水平(n=3)

2.2过表达组与vector组β-catenin表达水平比较

过表达组β-catenin表达水平为16.25±0.16，明显高于vector组的8.26±0.13，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3硼替佐米对过表达β-catenin的NCI-H929细胞活性影响

如表2所示，两组细胞活性随着硼替佐米浓度的增高而逐渐降低，其中Vector组活性均显著低于过表达组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2　硼替佐米对过表达β-catenin的NCI-H929细胞活性影响

3　讨　论

β-连环素(β-catenin)被认为是一种重要的细胞骨架蛋白，是细胞增殖、分化的重要信号因子，许多文献也已报道Wnt/β-catenin信号通路参与细胞周期、分化、凋亡以及病毒感染等重要生物学过程[6-8]。β-catenin在乳腺癌组织中高表达，且与乳腺癌组织学分级、肿瘤大小、肿瘤浸润深度及淋巴结转移明显相关。此外，其还会导致胰腺肿瘤病情进展[6]。魏德娥等[7]提出β-catenin的高表达在促使卵巢肿瘤进展过程中起着重要的作用，而且多变量回归分析结果显示，其可作为卵巢肿瘤患者的独立预后指标。杨西胜等[8]发现在肺癌组织中尤其EGFR突变的肺腺癌中，Wnt/β-catenin信号通路对肿瘤的增殖发挥着重要的促进作用,高表达β-catenin的患者预后明显差于低表达者。除此之外，β-catenin还能影响肿瘤细胞对抗肿瘤药物等的敏感性。例如：β-catenin作为致癌基因能促进胃癌的发生，是介导14-3-3σ蛋白类泛素化的E3酶，而14-3-3σ是细胞周期抑制因子与细胞凋亡、细胞分裂信号传导和肿瘤细胞耐药等密切相关[9]。TBP-2是一种硫氧还蛋白结合蛋白，与许多抗肿瘤药物的敏感性相关，β-catenin与HDAC1对TBP-2发挥协同抑制作用，可导致食管鳞状细胞癌对铂类药物发生抵抗[10]。然而，β-catenin在多发性骨髓瘤中表达情况及其对肿瘤药物敏感性影响的研究目前依然很少[11]。

本研究结果显示，在3种骨髓瘤细胞系中，β-catenin表达水平在RPMI8226细胞系中最高，而在NCI-H929细胞系中表达最低；因此本组选取NCI-H929细胞系，利用慢病毒转导技术构建过表达β-catenin细胞系，并采用western blotting法进行鉴定，结果显示过表达组中β-catenin蛋白的表达量明显高于对照组，说明过表达β-catenin细胞系被成功构建；本组设置了5个不同浓度梯度的硼替佐米处理NCI-H929-β-catenin和NCI-H929-vector细胞24 h后，行CCK-8检测发现vector组细胞活性明显低于过表达组，这说明过表达β-catenin能明显降低NCI-H929细胞对硼替佐米的敏感性。

根据研究结果，本组推测，NCI-H929细胞过表达β-catenin时可能降低细胞对硼替佐米的敏感性。然而，本实验只是初步实验，也许还存在其他生物因子影响细胞对硼替佐米的敏感性；敲低RPMI8226细胞中β-catenin能否提高细胞对硼替佐米的敏感性等还有待于进一步研究。

[1] 向昕,丁忠奇,李毅，等.三氧化二砷联合化疗治疗多发性骨髓瘤30例的临床观察[J].中华生物医学工程杂志，2014，20(2)：157-159.

[2] 蒲亚迪，李丽珍，马道新，等.硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞株KM3/BTZ的建立[J].山东大学学报，2013，51(2)：33-37.

[3] 庞缨汤,李澄宇,谢玮，等.硼替佐米对多发性骨髓瘤CLC-3表达的影响[J].现代肿瘤医学，2015，23(16)：2383-2386.

[4] 路丽，姚宏.β-连环素和Axin的表达与胃癌发生及预后关系的研究[J].实用医技杂志，2009，16(5)：343-345.

[5] 薛令军，李培梅，孙瑜宁，等.β-连环素和P65在喉癌中的表达及其临床意义[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志，2011，17(1)：11-17.

[6] 曾洲红,朱秀梅,袁夏华，等.COX-2、β-catenin及E-cadherin在乳腺肿瘤中的表达及相关性研究[J].当代医学,2012,18(17):25-26.

[7] 魏德娥,徐永萍.Wnt信号通路成分β-catenin和APC在卵巢肿瘤中的表达及意义[J].现代妇产科进展,2010,19(10):732-738.

[8] 杨西胜,汪建林,李小磊，等.β-catenin参与肿瘤干细胞形成和增殖转移的研究进展[J].现代肿瘤医学,2014,22(4):941-943.

[9] 冯琛,周雨峡,许科斌,等.Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白在胃癌组织中的表达和肿瘤转移的关系[J].现代生物医学进展,2014,14(21):4109-4159.

[10] 甘思远,钟雪云,谢思明，等.肿瘤耐药相关蛋白及β-catenin在食管鳞状细胞癌中的表达及意义[J].癌症,2010,29(31):323-329.

[11] 许永会,陈建斌,袁海汀，等.PCDH10通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖[J].第三军医大学学报,2015,37(14):1471-1477.

(本文编辑:张辉)

β-catenin expression level in myeloma cell lines and its effect on Bortezomib sensitivity

FengYao*,XiaYong,LiLei,XuShaoshan

(DepartmentofLaboratoryInvestigation,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China)

*Correspondingauthor:Email:565421060@qq.com

Objective:To study the expression level of β-catenin in myeloma cell lines and its effect on Bortezomib sensitivity. Methods: Three cell lines of myeloma were cultured,and detected for β-catenin expression by qRT-PCR. For each of these cell lines,a β-catenin over-expression group was constructed by lentivirus transfection,and a blank plasmid control group was also prepared. CCK-8 was detected to measure the effect of Bortezomib on viability of myoma cells. Results: The β-catenin expression level was the highest in RPMI8226 cell line,which was significantly higher than that in the NCI-H929 cell line (P<0.05). The β-catenin protein expression level was significantly higher in over-expression group than that in control group of all cell lines (P<0.05). Compared with the control groups,over-expression groups showed significantly higher cell viability(P<0.05). Conclusion: Over-expression of β-catenin in myeloma NCI-H929cell line may reduce the sensitivity of cells to Bortezomib.

myeloma cells; bortezomib; β-catenin

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.01.002

Email:565421060@qq.com

R733.3

A

2095-9664(2016)01-0006-03

2015-12-15)