肠道菌群对非酒精性脂肪性肝病病变程度的影响

郑啼婴　李瑜元　聂玉强　曹　杰　古维立　杜艳蕾，3　邱睿睿　周永健

(1广州市第一人民医院消化内科,广东 广州510180；2广州市消化疾病中心,广东 广州 510180；3广州市消化病重点实验室，广东 广州 510180)



·论著·

肠道菌群对非酒精性脂肪性肝病病变程度的影响

郑啼婴1，2李瑜元1，2聂玉强1，2曹杰2古维立2杜艳蕾2，3邱睿睿1，2周永健1，2*

(1广州市第一人民医院消化内科,广东 广州510180；2广州市消化疾病中心,广东 广州 510180；3广州市消化病重点实验室，广东 广州 510180)

目的:研究大鼠体内不同肠道菌群状态的改变对其非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发生发展的影响，为菌群失调动物模型的造模提供新方法，也为NAFLD在肠道菌群方面的防治提供可靠的理论依据。方法：50只雄性SD大鼠随机分为5组，其中3组使用高剂量抗生素头孢曲松溶液灌胃，建立肠道菌群失调模型后分为C组、D组和E组，C组饲以普通饲料、D组为高脂饲料、E组高脂饲料喂养同时使用益生菌灌胃，此3组在喂养期间，继续饮用低浓度头孢曲松溶液以保持肠道菌群失调状态；另2组生理盐水灌胃，作为肠道菌群正常模型，分为A组和B组，分别饲以普通饲料、高脂饲料。12周后收集标本，检测血脂、肝功能指标，行病理组织学检查明确肝组织病变程度，采用ELISA法测定血清脂联素水平。结果：同为普通饲料喂养的A组肝脏正常,而C组大鼠则出现少量的脂肪空泡。高脂饲料喂养的大鼠均造模NAFLD成功，B组肝脏为单纯性脂肪肝改变，抗生素作用的D组出现脂肪性肝炎(NASH)，而益生菌干预的E组肝脏虽有炎症改变，但病变程度较D组大为改善。除D组血清脂联素水平明显降低外(P<0.05)，其余各组大鼠均与A组无明显差异(P>0.05)。结论：肠道菌群的变化与NAFLD的发展存在明显的相关性，肠道菌群越紊乱，NAFLD病变程度越严重。微生态制剂可调节肠道菌群构成、改善NAFLD病变；血清脂联素浓度可能受血脂和肠道菌群双重影响，对肝脏起保护性作用，当NAFLD病变进展到NASH阶段时出现明显降低。

肠道菌群；NAFLD；脂联素；抗生素；益生菌

随着现代人生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)发病率明显上升，已跃居我国肝病第二位。本病虽进展缓慢，但是它能增加其它代谢性疾病的风险。在大多数NAFLD病例中，代谢性及心血管疾病的危险性要比肝脏病变本身更大,是NAFLD患者首要死亡原因[1]。自1998年Marshall提出了“肠-肝轴”概念以来，肠道微生态在NAFLD发病机制的作用受到越来越多的重视。在过去十多年中，越来越多累积的研究正不断地揭示两者之间的关系[2]。在NAFLD中，肠源性和脂肪组织来源的因子是作用并导致肝脏炎症的关键因素[3]。而脂联素(adiponectin,APN)是由脂肪细胞分泌的多肽或蛋白质，是目前发现的唯一对NAFLD起正性调节作用的脂肪细胞因子。但是在NAFLD的发病机制中，肠道微生态及脂联素之间是否相关，国内外研究还未见相关报道，本研究使用抗生素和益生菌构建不同肠道菌群状态的大鼠模型，观察NAFLD病变程度及脂联素浓度变化，探讨肠道菌群与脂联素可能存在的关系及其在NAFLD中发挥的作用。

1　材料与方法

1.1实验动物

6～7周龄SPF级雄性SD大鼠50只，初始体质量160～180 g，购自广东省医学实验动物中心(生产许可证编号：SCXK(粤)2013-0002)。饲养于广州医科大学实验动物中心SPF屏障系统，昼夜节律。高脂饲料参考国家食品药品标准，由52.2%普通饲料、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠、20%蔗糖、10%酪蛋白、0.6%磷酸氢钙、0.4%石粉、0.4%预混料构成，购自广东省实验动物中心;普通饲料由广州医科大学实验动物中心供应。

1.2药品及试剂

头孢曲松购自上海罗氏制药有限公司(编号：MC14026；生产批号：SH1731)，规格为1 g/瓶，分别配制157.5 mg/mL的高浓度溶液和0.35 mg/mL的低浓度溶液。 培菲康购自上海信宜药厂有限公司(生产批号：04720141018)，规格为36粒/瓶(210 mg/粒)，浓度配制为35.0 mg/mL。大鼠脂联素试剂盒购自美国RnD公司。

1.3实验方法

1.3.1动物模型建立与分组将50只雄性SD大鼠随机分为5组，其中3组使用高剂量抗生素头孢曲松溶液灌胃建立菌群紊乱大鼠模型：按体质量每只1 mL/100 g计算灌胃剂量，一天2次，间隔为6 h，连续4 d，第5天取所有大鼠的粪便行粪便涂片法检测菌群失调情况。当大鼠出现黏液软便、Ⅲ度菌群失调判断为造模成功。将菌群紊乱大鼠分为C组(紊乱普通饲料组)、D组(紊乱高脂饲料组)和E组(紊乱高脂饲料培菲康组)，C组饲以普通饲料、D组为高脂饲料、E组高脂饲料喂养同时使用益生菌灌胃。此3组在喂养期间，继续饮用低浓度头孢曲松溶液以保持肠道菌群失调状态。另2组相同时间以等体积生理盐水灌胃，作为肠道菌群正常模型，分为A组(正常普通饲料组)和B组(正常高脂饲料组)，分别饲以普通饲料、高脂饲料。

1.3.2药物干预每周，菌群紊乱大鼠模型(C组、D组和E组)在周四至周日连续4 d自由饮用浓度为0.35 mg/mL的头孢曲松溶液，以保持肠道菌群失调状态，而周一至周三的3 d中，将饮水改为SPF级洁净水的同时，E组用培菲康溶剂灌胃进行干预(抗生素可使培菲康疗效减少或消失，故使用培菲康时停用抗生素)，按照每次1 mL/100 g灌胃，1次/d。根据对照原则，其它4组需同时给予同等剂量的生理盐水灌胃。每天上午9:00-10:30为灌胃时间，共持续13周。

1.3.3标本收集及检测指标12周末，大鼠禁食不禁水12 h，10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉。经下腔静脉采血，用肝素锂真空采血管取2 mL血液送检验科行生化指标检测。另一管血液用干燥真空管分装，室温下自行凝固后以3 200 r/min低温离心5 min，取上层血清-80 ℃冰箱冻藏，用于ELASA法行APN浓度测定。分离肝脏，称取肝脏湿重，留取相同部位固定于4%多聚甲醛缓冲液中，常规制成石蜡切片，行HE染色及Masson染色。

1.4统计学分析

2　结　果

2.1各组大鼠一般情况

D组(紊乱高脂饲料组)大鼠在饲养较早期即出现反应迟钝，行动呆滞等表现，B(正常高脂饲料组)和E组(紊乱高脂饲料培菲康组)大鼠随着时间的增长也逐渐出现行动迟缓，其余2组大鼠精神均较佳，无明显差异。

2.2各组大鼠粪便情况

A组(正常普通饲料组)大鼠粪便黑硬；B组(正常高脂饲料组)大鼠便软，颜色偏黄。抗生素作用的30只大鼠粪便虽大部分成形但稀软、偶有稀烂便，色黄，气味较臭，尤见于喂高脂饲料的D组(紊乱高脂饲料组)，其中培菲康灌胃的E组(紊乱高脂饲料培菲康组)大鼠粪便稀软情况改善，表面无水。

2.3体重、肝重、肝指数比较

在每周的称重观察中，高脂喂养的B、D、E组大鼠生长速度较普通饲料喂养的A、C组慢。12周末，高脂饲料喂养的SD大鼠体型消瘦、体重轻，即B、D体重较A、C组体重下降(P<0.01),但肝重和肝指数显著增加，且P<0.01。E组与D组、A组与C组及B组与D组相比，指标均无明显差异(P>0.01)。见表1。

2.4各组大鼠生化指标比较

NAFLD大鼠模型的B、D、E组肝功能存在不同程度损伤，组内的A组与B组、C组与D组之间差异有统计学意义(P<0.01)。各组血清TG均无差异；血清TC及血清D-LDL浓度，高脂喂养的B组与D组较正常喂养的A组与C组明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01)；血清HDL-C浓度，C组比A组、D组高，差异有统计学意义(P<0.01)，其余无差异。见表2。

2.5各组大鼠血清APN含量

D组(紊乱高脂饲料组)血清APN浓度下降明显[(7.49±0.58)μg/mL]，与B组(正常高脂饲料组)[(9.90±1.05)μg/mL]、C组(紊乱普通饲料组)[(9.12±2.28)μg/mL]和E组(紊乱高脂饲料培菲康组)[(8.99±1.60)μg/mL]之间的差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　各组SD大鼠体重、肝重及肝指数

注：与A组比较，*P<0.05;与C组比较，#P<0.05

表2　各组SD大鼠生化指标

注：与A组比较，*P<0.01;与C组比较，#P<0.01

2.6各组大鼠肝脏病理学改变

HE染色显示，A组(正常普通饲料组)肝小叶完整，肝细胞形状正常、核结构清楚、胞质丰富均匀，以中央静脉为中心呈放射状排列，胞内未见脂滴浸润，汇管区及肝小叶内无炎细胞浸润；C组(紊乱普通饲料组)肝组织结构基本正常，仅见中心静脉周围散在少量脂滴。高脂喂养的正常B组呈单纯性NAFLD改变，为小泡性脂肪变，少量炎细胞侵润；D组(紊乱高脂饲料组)出现明显的肝脂肪变性及炎细胞浸润，肝小叶辨认不清，肝细胞胞质内可见脂肪滴溶解所致的大小不等的空泡，多融合成大泡性脂肪变，胞核被挤到细胞边缘；E组(紊乱高脂饲料培菲康组)仍存在肝细胞脂肪变性及炎症浸润，但多为小泡性脂肪变。Masson染色显示，D组部分大鼠肝脏汇管区纤维组织增生，汇管区周围可见纤维间隔。见图1,图2。

BACDE注：A：正常普通饲料组；B:正常高脂饲料组；C:紊乱普通饲料组；D:紊乱高脂饲料组；E:紊乱高脂饲料培菲康组

图1　各组大鼠肝脏HE染色病理切片(×400)

图2各组大鼠肝脏Masson染色病理切片(×400)

3　讨　论

肠道微生物群是一个新认识的人体重要“器官”，且呈动态变化，分娩方式、饮食结构、运动、压力、抗生素使用等都可引起结构的改变[4]。Mouzaki等[5]研究发现，NASH的发病与粪便中拟杆菌的含量呈负相关，而与饮食/BMI无关，这提示着肠道菌群在NAFLD 的发展过程中可能扮演着重要的角色。菌群失调会导致内毒素增高甚至造成肠源性内毒素血症，这些都作为重要因素参与了肝损的第二次打击，内毒素的持续增高导致NAFLD病程的不断进展。NAFLD 发展到一定阶段后，又会反过来影响肠道微生态平衡，两者形成恶性循环，相互影响。Masc等[12]人研究发现血清脂联素水平与肝脏脂肪变性、炎症和纤维化程度呈负相关。脂联素是由脂肪细胞分泌的多肽或蛋白质，具有增加胰岛素敏感性、抗肝脂肪沉积、抗炎及抗纤维化、抗氧化应激等特异性生物活性的作用。肠道菌群是否与脂联素之间有相关性，本实验进行了初步探讨。

大量研究已证实高脂饮食[6]、抗生素[7]、益生菌[8-9]等均可影响肠道微生态的变化。本实验结果显示，高脂饮食是影响大鼠体重、肝重及肝指数的主要因素。高脂饮食的大鼠体重较正常大鼠反而下降，但是肝脏出现明显脂肪变,此项结果与Mouzaki[5]的研究结果相合，说明NASH的发病与BMI无关。另一可能原因，本组认为高脂大鼠存在代谢综合征，与糖尿病患者常有体重减轻的临床症状相似，研究已证实糖尿病患者亦存在代谢综合征，这可作为高脂饮食体重反而体重减轻的一种解释。正常高脂饲料组大鼠，肝功能出现损伤，血脂水平较正常增加，肝脏病理结果显示病变仅发展至单纯性脂肪肝，并未进展至NASH。紊乱高脂饲料组大鼠，肝功能严重损伤，肝脏出现NASH，血脂明显紊乱，伴有较严重的代谢综合征。而紊乱高脂饲料培菲康组大鼠，肝脏病变较紊乱高脂饲料组有明显改善。正常普通饲料组及紊乱普通饲料组大鼠肝脏病理无明显改变，但紊乱普通饲料组仍可见少量散在的脂肪滴。以上结果提示，在NAFLD的发生发展过程中，高脂饮食造成的脂质代谢紊乱起关键性作用，而肠道菌群可能起推波助澜的效果，可促进NAFLD的发展。在血清APN的测定中发现，紊乱高脂饲料组大鼠APN浓度明显降低，其余各组均与正常普通饲料组无明显差异，提示血清APN与肝脏病变程度相关，病变越严重，APN的表达水平越低。一般在肝脏病变达到NASH程度时，血清APN才出现明显改变。紊乱高脂饲料组的血清APN水平比紊乱高脂饲料培菲康组明显升高，差异有统计学意义，提示改善肠道菌群可使APN的表达水平保持在正常水平从而发挥保护作用。

本研究通过普通饲料、高脂饲料、抗生素处理后普通饲料、抗生素处理后高脂饮食同时诱导、抗生素处理后高脂饮食再加用培菲康干预等5种喂养方式，为不同肠道菌群状态的造模提供方法依据。通过设置不同状态的肠道菌群，可进一步探讨肠道微生态与NAFLD病变的关系。然而，本实验亦存在不足之处。因抗生素可抑制培菲康的作用，与培菲康不可同时使用，实验中对大鼠的培菲康灌胃处理采用了分时段的方式，这可能会造成因培菲康剂量不足，最终影响疗效而出现实验结果的不准确性。此外，动物饲养时间为12周，抗生素造模成菌群紊乱后饲以普通饲料的大鼠模型并未出现明显的肝脂肪变，因而未能证明肠道菌群在NAFLD的发生过程中起主要作用。本组推测延长饲养周数可能会有更显著的改变，建议后来者可尝试改变饲养时间。

综上所述，本研究用一种新的研究方式，再次证明了肠道菌群的变化与NAFLD发展存在明显的相关性，结果与前人的研究报告相符。在进一步的研究中，发现血清APN与肠道菌群有关，推测肠道菌群可能通过影响脂联素的表达起作用，但是具体的致病机制尚未明确，此后的研究中可进行脂联素mRNA测定或甲基化水平测定，从基因水平进行验证。此外，在NAFLD发展过程中，血清APN并非一开始就降低，推测在病变初期，它能保持一定浓度，从而对肝脏起保护性作用。另外，为更深入了解NAFLD病变中肠道微生态的变化情况，在后期的研究中，将采用基因组高通量测序对肠黏膜进行细菌序列的分析。目前对NAFLD的治疗尚无疗效确切的药物及方案，鉴于肠道菌群及血清脂联素在NAFLD中的重要作用，使用微生态制剂和脂联素及其受体激动剂可能成为NAFLD的新疗法。

[1] Stepanova M, Rafiq N,Hmakhlouf H，et al. Predictors of all-cause mortality and liver-related mortality in patients with non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)[J].Dig Dis Sci，2013，58(9):3017-3023.

[2] Vanni E, Bugianesi E,Bugianesi E,et al.The gut-liver axis in nonalcoholic fatty liver disease: another pathway to insulin resistance[J].Hepatology，2009，49(6):1790e21790-1792.

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(本文编辑:王馨)

Impact of intestinal flora on severity of non-alcoholic fatty liver disease

ZhengTiying1，2,LiYuyuan1，2,NieYuqiang1，2,CaoJie2,GuWeili2,DuYanlei2，3,QiuRuirui1，2,ZhouYongjian1，2*

(1DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstMunicipalPeople′sHospital,Guangzhou510180;2GuangzhouDigestiveDiseaseCenter,Guangzhou510180;3GuangzhouKeyLaboratoryofDigestiveDiseases,Guangzhou510180,China)

*Correspondingauthor:Email:13503060150@126.com

Objective:To investigate the impact of dysregulated intestinal flora on occurrence and development of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), so as to provide a new method for animal modeling of dysregulated intestinal flora, and to provide a reliable theoretical basis for the prevention and treatment of dysregulated intestinal flora in NAFLD. Methods: Fifty male SD rats were randomly divided into five groups. Three groups of rats received garvage of high-dose oral ceftriaxone for modeling of dysregulated intestinal flora, and were then assigned as groups C, D and E. The group C was fed on usual diet, D on high-fat diet, and group E on high-fat diet plus oral probiotics. During the feeding, these three groups were kept on low-dose oral ceftriaxone to maintain a status of dysregulated intestinal flora. The other two groups, assigned as groups A and B, received garvage of normal saline for modeling of normal intestinal flora, and were fed on usual diet and high-fat diet, respectively. After 12 weeks, rat liver tissue specimens were collected. Serum lipid level and liver functions were measured. Histopathological study was performed to examine the severity liver lesions. ELISA assay was used to determine the serum adiponectin level. Results: For rats on usual diet, the liver tissues of group A appeared normal, whereas those of group C presented a few fatty vacuoles. Rats fed on high-fat diet were successfully modeled for NAFLD. the liver tissues of group B presented simple signs of liver steatosis, whereas those of the ceftriaxone-treated group D showed signs of non-alcoholic steatohepatitis (NASH). With probiotics intervention, the liver tissues of group E presented inflammatory changes, but the severity was greatly improved compared with group D. Except for group E with significantly lower adiponectin level (P <0.05), there was no significant difference in serum adiponectin level between group A and the other groups of rats (P> 0.05). Conclusion: Alteration in intestinal flora is significantly related to development of NAFLD, with greater severity of dysregualted intestinal flora, more serious NAFLD. Probiotics may modify the composition of intestinal flora, and improve the NAFLD lesions. The level of serum adiponectin which appears to be hepatoprotective, may be affected both by serum lipids and intestinal flora, and may become significantly lowered when NAFLD evolves into NASH.

intestinal flora; NAFLD; adiponectin; antibiotics; probiotics

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.01.003

Email:13503060150@126.com

R575.5

A

2095-9664(2016)01-0009-05

2015-12-15)