心脏扩大患者血浆微RNA-30a表达的变化

潘　伟　赵　娟　杨泽福　罗韶金　黄景文

(1南方医科大学附属南海医院心内科，2超声科，广东 佛山 528200)



·临床研究·

心脏扩大患者血浆微RNA-30a表达的变化

潘伟1*赵娟2杨泽福1罗韶金1黄景文1

(1南方医科大学附属南海医院心内科，2超声科，广东 佛山 528200)

目的:探讨心脏扩大患者血浆中微RNA(miR)-30a表达变化。方法：将2014年1月至2014年12月本院208例患者按心脏超声检查结果分为心脏扩大组(n=112)、心脏腔室大小正常组(n=96)。RT -PCR法检测miR-30a含量。比较两组患者血浆miR-30a水平并应用相关分析探讨miR-30a水平与左室舒张期末内径(LVDd)和左心房内径(LA)的关系。结果:与心脏正常组相比，心脏扩大组血浆miR-30a水平明显升高，miR-30a与LVDd、LA呈正相关(R=0.657、0.516，均P=0.000)。结论:血浆miR-30a可作为心脏重构的潜在标志物。

心脏扩大；微RNAs；超声检查，多普勒，彩色

微RNA(miR)可以调控靶基因而在疾病的发生发展中起作用，目前报道的miR有1.8万多个[1]。近年来，对miR-30的研究涉及广泛。目前报道的人类和褐家鼠miR-30家族有miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d和miR-30e 6个亚型。我们前期的研究显示，miR-30a下调引起的心肌自噬过度激活介导了心脏重构[2]。我们拟观察心脏扩大患者外周血浆 miR-30a水平的变化，以为进一步观察血浆miR-30a的变化是否能预测心衰患者的预后。

1　资料与方法

1.1研究对象

2014年1月至2014年12月208例收住本院心血管内科的住院患者，年龄55～82岁。包括高血压、冠心病、扩张型心肌病、风心病、心力衰竭和糖尿病。按心脏超声分为心脏扩大组112例、心脏腔室大小正常组96例。心脏扩大入选标准：男性左室舒张期末内径(LVDd)>55 mm，女性LVDd>50 mm；左心房内径(LA)>30 mm。心脏腔室大小正常组患者男性LVDd<55 mm，女性LVDd<50 mm； LA<30 mm。心脏扩大及心脏腔室大小正常组均剔除：肿瘤、急性期感染、帕金森病、特发性肺纤维化、休克、肝硬化等近期应用过干扰素、苯巴比妥。

1.2方法

所有入选患者完善一般临床资料，次日空腹采血，空腹时EDTA 抗凝管收集全血，获取血浆，检测miR-30a。血清酸、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、血糖等采用检验科全自动生化分析仪检测。由专人质控。心脏超声检查由富有经验的超声医师完成，并测定LVDd、LA。

1.2.1检测miR-30a 血浆标本收集用EDTA抗凝管收集3 mL全血，室温放置1～2 h。1 600 ×g，4 ℃，15 min离心。获取上层的血浆。12 000 ×g，4 ℃，15 min离心。获取上清放在-80 ℃保存。

1.2.2血浆miR-30a 检测 取300 μL血浆加入1.2 mL TRIzol LS Reagent溶液(美国Invitrogen)及2 μL人工合成的cel-miR-39(1 nmol/L)(美国Invitrogen)作为内参，迅速震荡摇匀 30 s，再加入200 μL氯仿，强烈震荡20 s后静置3 min。室温14 000 ×g离心10 min 。获取上层水层。加入10 μL SiO2吸附液，混匀，14 000 ×g离心5 min。弃上清，加入75%乙醇400 μL，14 000 ×g 离心5 min。弃上清，风干5 min，加入25 μl DEPC水溶解。10 mmol/L dNTP 、RNase抑制剂、miR-30a反转录引物(美国Invitrogen)、cel-miR-39反转录引物(美国Invitrogen)、5×buffer、M-MLV 加入到上溶液中，混匀后42 ℃孵育60 min，85 ℃孵育10 min。采用SYBR Green PCR Master Mix(日本 TOYOBO)进行qRT-PCR，反应参数：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40个循环。引物序列：miR-30a正向引物：5’ACACTCCAG-CTGGGTGTAAACATCCTCGACTG 3’；cel-miR-39：5’ACACTCCAGCTGGGTCACCGGGTGTAAATCAGCT 3’;miRNA反向引物：5’ CTCAACTGGTGTCGTGGA 3’。PCR产物经琼脂糖电泳鉴定扩增的片段大小与目的基因相一致。熔解曲线呈单峰。PCR每个样品做3个复孔，并重复荧光定量PCR检测，曲线一致。结果取平均值。经荧光信号理论方程推导出基因表达量计算公式，计算相对表达量=2-ΔΔct。

1.3统计学处理

2　结　果

2.1两组临床基线资料比较

对照组与心脏扩大组两组临床基线指标差异无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

2.2心脏扩大患者血浆miR-30a表达的变化

对照组与心脏扩大组LA、LVDd、miR-30a经Shapiro-Wilk检验，两组资料均为正态资料。与对照组比较，心脏扩大组患者LA、LVDd、miR-30a升高(均P<0.05)。见表2。

表1　一般资料比较

表2　心脏扩大患者心脏内经与miR-30a表达的变化±s)

2.3血浆miR-30a与心脏大小的相关性

将血浆miR-30与LA、LVDd行Pearson相关性分析，miR-30与LA、LVDd均正相关，相关系数R值分别为0.516、0.657(均P<0.05)。

3　讨　论

在各种病理刺激下，心脏出现实质和间质的结构改变，如心肌细胞肥厚、心脏间质纤维化等，称为心脏重构。心脏重构是心力衰竭发生发展的基本机制。临床表现主要为心脏扩大[3]。而血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在心脏重构中扮演重要的角色[3]。但关于AngⅡ通过哪种途径导致心脏重构的研究很少。

我们的前期研究显示心脏重构大鼠心脏组织miR-30a下调。AngⅡ可通过下调心脏组织miR-30a的表达导致心脏重构[2]。另一项研究同样证实miR-30在心脏重构中起作用[4-5]。而临床患者重构的心脏组织标本难以获取。我们推测外周循环血miR-30a可能能够反映心脏重构的变化。故我们在该项进一步的临床研究中观察心脏扩大患者血浆miR-30a的变化。我们的研究结果显示与对照组比较，心脏扩大患者血浆miR-30a升高。而在我们前期的研究中，重构后的心脏组织miR-30a下调[2]。这种重构后的心脏组织miR-30a水平与血浆miR-30a水平相背离的现象，我们认为可能与心脏扩大时心脏组织miR-30a释放到外周循环血所致。关于这个假设的验证和miR-30a的转移途径值得进一步研究。而且，血浆miR-30a升高能否预测心脏重构，有待进一步临床研究证实。

心脏重构主要表现为左心房和左心室的重构[6]。我们该研究数据显示左心房与左心室内径与血浆miR-30a均正相关。其原因为心室或者心房容积扩大为AngⅡ介导引起，而AngⅡ可刺激心脏组织miR-30a的分泌，并有可能向外周循环血释放。而左心房与左心室内径能预测患者的预后[7]。那么，血浆miR-30a有可能预测患者的预后。评估心脏重构的传统检测手段有超声心动图、心电图描记和心脏磁共振成像。这些检测手段获取反映心脏重构临床参数的灵敏度有待提高，而且超声心动图和磁共振成像的医疗较高。血浆miR-30a的变化可能更灵敏地反映患者的心脏重构。

本研究检测血浆miR-30a 应用的是染料法，而国外文献大部分是用TaqMan法，后者更加准确，但费用较前者高。

综上所述，心脏扩大组患者血浆miR-30a较心脏正常组明显升高。 血浆miR-30a与心脏扩大相关。血浆miR-30a水平的改变可能预测心脏重构和心力衰竭的发生，有可能预测患者的预后。

[1] 杨丽媛,彭小芳,刘海英. 微RNA-140-3p的研究进展[J] 中华生物医学工程杂志,2015(4):378-382.

[2] Pan W,Zhong Y,Cheng CF,et al. miR-30-regulated autophagy mediates angiotensin Ⅱ-induced myocardial hypertrophy[J]. PLoS One,2013,8(1):e53950.

[3] Mayer SC,Gilsbach R,Preissl S,et al. Adrenergic Repression of the Epigenetic Reader MeCP2 Facilitates Cardiac Adaptation in Chronic Heart Failure[J]. Circ Res,2015,117(7):622-633.

[4] Zhao QD,Viswanadhapalli S,Williams P,et al. NADPH oxidase 4 induces cardiac fibrosis and hypertrophy through activating Akt/mTOR and NFκB signaling pathways[J]. Circulation,2015,131(7):643-655.

[5] Guo R,Hu N,Kandadi MR,et al. Facilitated ethanol metabolism promotes cardiomyocyte contractile dysfunction through autophagy in murine hearts[J]. Autophagy,2012,8(4):593-608.

[6] Kao YH,Liou JP,Chung CC,et al. Histone deacetylase inhibition improved cardiac functions with direct antifibrotic activity in heart failure[J]. Int J Cardiol,2013,168(4):4178-4183.

[7] Bombelli M,Facchetti R,Cuspidi C,et al. Prognostic significance of left atrial enlargement in a general population:results of the PAMELA study[J]. Hypertension,2014,64(6):1205-1211.

(本文编辑:刘新艳)

Change of plasma micro RNA-30a expression in patients with cardiomegaly

PanWei1*,ZhaoJuan2,YangZefu1,LuoShaojin1,HuangJingwen1

(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofUltrasound,NanhaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Foshan,Guangdong528200,China)

*Correspondingauthor:Email：weipan1977@163.com

Objective:To investigate change of plasma micro RNA-30a (miR-30a) expression in patients with cardiomegaly. Methods:According to the findings of echocardiography,208 patients hospitalized in our hospital between January 2014 and December 2014 were divided into cardiomegaly group (n=112) and normal heart chamber size group (n=96). The content of miR-30a was measured by RT-PCR assay. The levels of plasma miR-30a between the two groups were compared. The correlation between miR-30a level and left ventricular end-diastolic diameter (LVDd)/left atrial (LA) diameter was determined. Results:Compared with normal heart chamber size group,the plasma miR-30a level in the cardiomegaly group was significantly increased,which was positively correlated with LVDd and LA (R=0.657 and 0.516,allP=0.000). Conclusion:Plasma miR-30a can be used as a potential marker for cardiac remodeling.

cardiomegaly; micro RNAs; ultrasonography,doppler,color

10.3969/j.issn.1008-1836.2016.02.011

广东省医学科研基金(A2014712)

Email：weipan1977@163.com

R541.6

A

2095-9664(2016)02-0042-03

2016-02-02)