γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号逆转马兜铃酸诱导的肾小管细胞表型转化

洪炜龙，陆 红，吴存造，夏 鹏，陈必成，白永恒（温州医科大学附属第一医院.外科实验室，.医学检验中心，.移植科，浙江温州 5000）

γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号逆转马兜铃酸诱导的肾小管细胞表型转化

洪炜龙1，陆 红2，吴存造3，夏 鹏3，陈必成1，白永恒1
（温州医科大学附属第一医院1.外科实验室，2.医学检验中心，3.移植科，浙江温州 325000）

目的 探讨γ-分泌酶抑制剂DAPT对马兜铃酸（AA）诱导引起肾小管上皮细胞表型转化与胶原累积的作用及分子机制。方法 将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为正常细胞对照组、AA 10 mg·L-1组、AA 10 mg·L-1+DAPT1和10 μmol·L-1组。24 h后，实时荧光定量PCR检测Notch信号关键分子Notch1、Jagged1和Numb、表型转化相关分子转化生长因子β1（TGF-β1）、E-钙黏着蛋白、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、骨形态发生蛋白7（Bmp7）和基质成分Ⅰ型胶原a1（Col1a1）和Ⅲ型胶原a1（Col3a1）mRNA的表达；细胞免疫荧光染色法检测Notch1、Jagged1、α-SMA和Col3a1蛋白的表达。结果 与正常细胞对照相比，AA处理后，肾小管上皮细胞基质相关因子TGF-β1，α-SMA和Col3a1 mRNA表达上调，上皮标志物E-钙黏着蛋白mRNA的表达受到抑制，而且导致了Notch1、Jagged1 mRNA表达的上调和Numb mRNA表达的下调（P＜0.05），提示AA促进肾小管上皮细胞表型转化与基质累积，同时激活了Notch信号通路。DAPT干预AA作用后，Notch1（P＜0.01）和Jagged1（P＜0.05）的mRNA表达下调，Numb mRNA表达上调（P＜0.05），说明DAPT抑制了AA诱导的Notch信号通路活化。此外，与AA损伤组相比，DAPT也降低了TGF-β1，α-SMA，Col1a1和Col3a1 mRNA表达（P＜0.05），提高BMP-7和E-钙黏着蛋白mRNA表达（P＜0.05），提示DAPT抑制了AA诱导的上皮细胞的表型转化与基质累积。结论 DAPT抑制AA诱导的肾小管上皮细胞的表型转化与基质累积，其可能机制是DAPT靶向干预Notch信号的活化。

DAPT；马兜铃酸；表型转化；基质累积；Notch信号

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.005

Notch信号通路进化中高度保守，其调控细胞增殖、分化和凋亡的功能几乎涉及所有组织和器官。正常表达的Notch信号在器官发育和器官修复再生过程中起着重要作用［1-2］，但持续异常激活的Notch信号可导致肝癌等多种肿瘤的发生［3］。Notch信号活化也参与了肝、肺等多种器官组织的纤维化［4-7］，但马兜铃酸（aristolochic acid，AA）所致的肾纤维化中的作用及分子机制尚未明确［1-2，8］。前期研究表明，AA可致肾小管上皮细胞表达并释放转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），促使上皮细胞向间充质细胞转化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT），最终导致基质成分Ⅰ型胶原蛋白（typeⅠcollagen a1，Col1a1）和Ⅲ型胶原蛋白a1（Col3a1）过度累积［9-10］。在此过程中，损伤的上皮细胞反馈性诱导与增殖相关信号的活化，引起细胞的异常增殖，推动EMT和基质累积。（2S）-N-［N-（3，5-二氟苯乙酰基）-L-丙氨酰］-2-苯基甘氨酸叔丁酯｛N-［N-（3，5-difluorophenacetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT｝为一种γ-分泌酶抑制剂，研究表明，DAPT可阻断由γ-分泌酶介导的Notch信号受体的酶切过程，使受体分子无法转变成有效的活性片段，从而抑制Notch信号通路的激活。DAPT的特异性强，在有效范围内尚不引起毒副作用，而且也已被证明在抗肿瘤方面具有潜在作用［11］。本研究应用DAPT，观察其对AA所致的EMT、基质累积及Notch信号活化的影响。

1　材料与方法

1.1细胞、试剂和主要仪器

大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。AA和DAPT（美国Sigma公司）；DMEM细胞培养液，胎牛血清，胰蛋白酶和Trizol提取液（美国Gibco公司）；抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（美国Santa Cruz公司）；抗Ⅲ型胶原抗体和TRITC（美国 Bioworld公司）；FITC（北京Solarbio公司）；RT-PCR试剂（美国Promega公司）。MyCycler梯度PCR仪，美国Bio-Rod公司；7500定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波长多功能扫描仪，美国Thermo Scientific公司；AMEX-1200倒置相差显微镜，美国Advanced Microscop Group公司；DM4000 B LED荧光正置显微镜，德国Leica公司。

1.2NRK-52E细胞培养和分组

用含5%胎牛血清的DMEM，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱培养。铺6孔板，待细胞融合度约为70%时，开始正式实验。分为正常细胞对照组；AA 10 mg·L-1组；AA 10 mg·L-1+DAPT 1和10 μmol·L-1组。培养24 h后，采用倒置相差显微镜观察细胞的形态改变。

1.3实时RT-PCR检测mRNA的表达

采用Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定260/280 nm吸光度值以确定浓度和纯度。根据RT-PCR试剂盒说明书将细胞RNA逆转录成cDNA，并用DEPC处理水稀释10倍。针对Notch信号关键分子Notch1、Jagged1和Numb、表型转化相关分子TGF-β1、E-钙黏着蛋白、α-SMA、骨形态发生蛋白7（bone morphogenic protein 7，Bmp7）Col1a1和Col3a1的mRNA设计特异性引物，以β肌动蛋白作为内参，用实时PCR相对定量法进行测定。引物序列如表1所示，由上海捷瑞公司合成。取逆转录产物1 μL进行实时PCR，PCR扩增体系：5 μL 2×SYBR绿色荧光定量试剂、上下游引物各1 μL，终浓度为200 nmol·L-1，1 μL cDNA，2 μL反应缓冲液。扩增程序为：95℃5 min，95℃10 s，60℃35 s，40个循环。通过溶解曲线评价PCR结果可靠性，采用2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。

1.4免疫荧光检测蛋白表达

取对数生长期NRK-52E细胞，设立正常细胞对照组，AA 10 mg·L-1损伤组和DAPT干预组并进行细胞爬片培养24 h，弃培养基，4%甲醛固定，0.3%Triton-X破膜，0.5%正常山羊血清封闭。各细胞爬片滴加针对Notch1、Jagged1、α-SMA、Col3a1、波形蛋白（vimentin）和E-钙黏着蛋白的一抗工作液，于4℃孵育过夜。用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）或四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC，红色）标记的二抗工作液，于37℃孵育60 min。滴加DAPI至细胞爬片上，于室温染色5 min。胞质绿色或红色与胞核蓝色为阳性着色。每组取10张片，每张取10个高倍视野（400×），用Image Pro Plus 6.0软件分析荧光积分吸光度值（integrated absorbance，IA）。

1.5统计学分析

采用SPSS13.0软件对结果数据进行统计学分析，统计分析结果以表示，两组样本间比较采用t检验与精确概率法，两组样本关联性比较采用相关性分析，多组样本间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

Tab.1 Specific mRNA primers for Notch-，epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）-and extra cellular matrixrelated genes

2　结果

2.1DAPT对马兜铃酸诱导NRK-52E细胞形态的影响

如图1所示，正常细胞密度极高，细胞间接触紧密，由于接触抑制，细胞形态小，呈铺路石状；与正常细胞对照相比，AA处理NRK-52E细胞后，细胞数量急剧下降，细胞损伤表现明显，失去贴壁作用，细胞漂浮在培养液中，并且细胞形态大，呈多形性。与AA 10 mg·L-1组相比，DAPT干预后，悬浮的细胞明显减少，贴壁细胞数量增加。但同时，随着DAPT浓度的增加，细胞数量也随着下降，推测可能与其细胞增殖的抑制作用相关。

Fig.1 Effect of DAPT on morphology of NRK-52E cells injuried by aristolochic acid（AA）（×200）.The cells were cultured for 24 h.

2.2DAPT对马兜铃酸诱导的NRK-52E细胞基质累积和TGF-β1表达的影响

细胞免疫荧光结果显示（图2），与正常细胞对照相比，AA 10 mg·L-1作用下，Col3a1蛋白的表达显著上调。AA 10 mg·L-1组的Col1a1和Col3a1 mRNA的表达水平升高（P＜0.05）（表2），提示AA诱导了肾小管上皮细胞基质过度的累积。DAPT干预后，Col3a1蛋白表达水平显著下调（P＜0.05），Col1a1和Col3a1的mRNA水平也显著下调（P＜0.05）。因此，DAPT对AA所致的基质累积起到了抑制作用，这种作用可能与下调的TGF-β1mRNA表达密切相关。

2.3DAPT对马兜铃酸诱导NRK-52E细胞中EMT相关mRNA的影响

实时PCR结果显示（表3），与正常细胞对照相比，AA 10 mg·L-1组肌成纤维细胞标志物α-SMA的mRNA表达水平上调（P＜0.05），上皮细胞标志物E-钙黏着蛋白的mRNA表达水平下调（P＜0.05）。免疫荧光结果显示（图3），AA 10 mg·L-1作用后，α-SMA的蛋白表达上调至正常细胞对照的9.705倍（P＜0.05）。DAPT干预后，E-钙黏着蛋白mRNA表达提高（P＜0.05），而α-SMA mRNA表达下降（P＜0.05）。EMT抑制因子Bmp7 mRNA表达上调（P＜0.05）。因此，DAPT可拮抗AA所致的表型转化进程。

Fig.2 Effect of DAPT on Col3A1 protein expression in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the treatment.

Tab.2 Effect of DAPT on mRNA expression of Col1a1，Col3a1 and TGF-β11in NRK-52E cells injured by AA

2.4DAPT对马兜铃酸诱导NRK-52E细胞中Notch信号的影响

实时PCR结果显示（表4），DAPT作用24 h后，随着DAPT浓度增加，Numb mRNA表达显著上调（P＜0.05），而Notch1和Jagged1的mRNA表达显著下调（P＜0.01，P＜0.05），提示Notch信号通路被抑制。免疫荧光结果也显示（图4），DAPT可抑制AA 10 mg·L-1所致的Notch1和Jagged1蛋白表达升高。

Tab.3 Effect of DAPT on mRNA expression of EMT-related molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.3 Effect of DAPT on protein expression of α -SMA in NRK-52E cells injured by AA（×400）.See Fig.1 for the cell tretament.

Tab.4 mRNA Expression of Notch signaling molecules in NRK-52E cells injured by AA

Fig.4 Effect of DAPT on protin expression of Notch1 and Jagged1 in NRK-52E cells injured by AA（×400）. See Fig.1 for the cell treatment.

3　讨论

本研究发现，γ-分泌酶抑制剂DAPT能显著抑制AA所致肾纤维化过程中Notch信号的活化，同时缓解肾小管细胞纤维化进程，甚至在一定程度上使得纤维化过程中肌成纤维样肾小管细胞重新获得上皮细胞表型。

AA损伤后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表达上调，肌成纤维细胞标志物α-SMA mRNA表达上调，上皮细胞标志物E-钙黏着蛋白表达下调，同时EMT抑制因子Bmp7 mRNA表达下调，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表达上调，Numb mRNA表达下调。结果显示，肾小管上皮细胞在受到AA损伤后，细胞外基质生成能力增强，上皮细胞表型特征减弱，而肌成纤维细胞样表型特征增强，同时EMT抑制能力下调。此外，Notch信号被活化。据此结果推测，在受到AA损伤后，肾小管上皮细胞发生了EMT和基质累积，进而导致了纤维化，而且Notch信号通路的激活可能参与这一过程。而相比于AA损伤组，DAPT干预后，Col1a1，Col3a1和TGF-β1mRNA表达下调，α-SMA mRNA表达下调，E-钙黏着蛋白mRNA表达上调，同时Bmp7 mRNA表达上调，此外，Notch1和Jagged1 mRNA表达下调，Numb mRNA表达上调。结果显示，AA损伤的肾小管细胞在受到DAPT干预后，细胞外基质生成能力下降，上皮细胞表型特征增强，而肌成纤维细胞样表型特征减弱，EMT抑制能力显著上调，同时Notch信号受到抑制。据此结果推测，在受到DAPT干预后，AA损伤的肾小管上皮细胞所发生的EMT和基质累积受到显著抑制，甚至出现逆转。此外，据此结果推断，Notch信号通路参与了AA诱导的肾小管细胞表型转化。

本研究虽然可推断DAPT抑制Notch信号逆转AA诱导的肾小管细胞表型转化，但要断定Notch信号是否直接参与表型转化和纤维化，并且要完整确认通过哪些通路来影响表型转化和纤维化，需要做进一步研究。此外，本研究针对体外实验，细胞模型的建立和药物干预的生化因素较体内条件有大幅简化，直观地对Notch信号在AA诱导的肾小管细胞表型转化过程的整个信号和分子网络中的作用进行准确的测评和定位，有待进一步研究。

综上所述，本研究初步从体外实验角度阐释DAPT可通过靶向阻断Notch信号，下调了AA诱导的TGF-β1的表达和释放，抑制EMT和胶原累积，最终缓解纤维化样改变。然而，DAPT干预Notch信号进而发挥抗纤维化作用尚需未来的体内实验予证实。本研究从信号转导的调控途径上查找有效的治疗药物，在一定程度上可为肾间充质纤维化的治疗提供新的思路。

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γ-Secretase inhibitor DAPT reduces aristolochic acid-induced phenotypic transformation by inhibiting Notch pathway in renal tubular epithelial cells

HONG Wei-long1，LU Hong2，WU Cun-zao3，XIA Peng3，CHEN Bi-cheng1，BAI Yong-heng1
（1.Wenzhou Key Laboratory of Surgery，2.Department of Laboratory Medicine，3.Department of Transplantation，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of γ-secretase inhibitor N-［N-（3，5-difluorophen⁃acetyl）-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester（DAPT）on phenotypic transformation and matrix accu⁃mulation induced by aristolochic acid（AA）in renal tubular epithelial cells（NRK-52E）and explore the mechanism.METHODS NRK-52E cells were divided stochastically into normal cell control group，AA 10 mg·L-1group and AA 10 mg·L-1+DAPT 1 and 10 μmol·L-1group.After 24 h，the mRNA expressions of Notch1，Jagged1，Numb，E-cadherin，transforming growth factor-β1（TGF-β1），α-smooth muscle actin（α-SMA），bone morphogenic protein 7（Bmp7），typeⅠ a1（Col1a1）andⅢ collagens a1 （Col3a1）were quantified by quantitative real-time RT-PCR.The protein expressions of Notch1，Jagged1，α-SMA，and Col3a1 in NRK-52E cells were detected by immunofluorescence staining.RESULTS In NRK-52E cells，AA enhanced the expression of TGF-β1，α-SMA and Col3a1 mRNA（P＜0.05），reduced the expression of E-cadherin mRNA（P＜0.05），up-regulated the mRNA expression of Notch1 mRNA（P＜0.01）and Jagged1（P＜0.05），and down-regulated the mRNA expression of Numb mRNA（P＜0.05）compared with normal cell control group，indicating that phenotypic transformation and matrix accumu⁃lation occurred in AA-treated NRK-52E cells，accompanied by activated Notch signaling.Treatment with DAPT inhibited Notch signaling by decreasing the expression of Notch1 and Jagged1（P＜0.05），and increasing the expression of Numb mRNA（P＜0.05）.Furthermore，DAPT also down-regulated the expression levels of TGF-β1，α-SMA，Col1a1 and Col3a1 mRNA（P＜0.05），and up-regulated the expression level of Bmp7 and E-cadherin mRNA（P＜0.05）compared with AA group，suggesting that DAPT inhibited phenotypic transformation and matrix accumulation in AA-treated NRK-52E cells. CONCLUSlON AA induces phenotypic transformation and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells，which is inhibited by DAPT treatment.The possible mechanism is that DAPT suppresses the activation of Notch signaling，resulting in the reduction of epithelial-to-mesenchymal transition and matrix deposition.

DAPT；aristolochic acid；phenotype transformation；matrix accumulation；Notch signaling

The project supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LQ16H310005）；Natural Science Foundation of Zhejiang Province（LY16H050007）；and Wenzhou Municipal Science and Technology Plan Project （Y20130149）

BAI Yong-heng，E-mail：greatsailor@163.com，Tel：（0577）88069338

R974，R966

A

1000-3002-（2016）03-0209-06

2015-10-23接受日期：2016-03-10）

（本文编辑：贺云霞）

浙江省自然科学基金（LQ16H310005）；浙江省自然科学基金（LY16H050007）；温州市科技计划项目（Y20130149）

洪炜龙，男，实验师，主要从事损伤后修复机制及干预研究。

白永恒，E-mail：greatsailor@163.com