呋喃二烯对人胃腺癌MGC-803细胞凋亡的诱导作用

郭健敏，陈 雨，周 云，韩 重，杨 威（1.广东省生物资源应用研究所药物非临床评价研究中心，广东广州 510990；2.广东莱恩医药研究院有限公司，广东广州 510990；3.广东药学院药科学院药理系，广东广州 510006）

呋喃二烯对人胃腺癌MGC-803细胞凋亡的诱导作用

郭健敏1，2，陈 雨2，3，周 云2，3，韩 重1，2，杨 威1，2
（1.广东省生物资源应用研究所药物非临床评价研究中心，广东广州 510990；2.广东莱恩医药研究院有限公司，广东广州 510990；3.广东药学院药科学院药理系，广东广州 510006）

目的 研究呋喃二烯（FDE）在体外对人胃腺癌MGC-803细胞凋亡的诱导作用。方法 FDE 46.29～740.74 μmol·L-1与MGC-803细胞孵育48 h，MTT法测定FDE对细胞存活的抑制率；FDE 92.58～370.32 μmol·L-1与MGC-803细胞作用24 h，光镜下及Hoechst 33342荧光染色分别观察细胞形态和细胞凋亡，流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期，罗丹明123染色和DCFH-DA荧光探针分别检测细胞线粒体膜电位的改变和活性氧的产生。结果 MTT结果表明，FDE 46.29～740.74 μmol·L-1对MGC-803存活具有明显抑制作用，作用24，48和72 h时IC50分别为347.91，257.41和101.01 μmol·L-1。流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染结果显示，FDE在92.58～370.32 μmol·L-1作用24 h，能显著促进MGC-803细胞凋亡（P＜0.05）。细胞周期检测结果表明，FDE可使MGC-803细胞周期阻滞于S期。罗丹明123和DCFH-DA染色结果显示，当药物浓度为370.37 μmol·L-1时，FDE使细胞内线粒体膜电位降低（P＜0.05），对应荧光强度的细胞比例与对照组的比值为0.85∶1，使细胞内活性氧水平增加，活性氧水平为对照组的1.30倍（P＜0.05）。结论 FDE可抑制人胃腺癌MGC-803细胞存活，并诱导其凋亡，其诱导凋亡的作用机制可能与激活线粒体凋亡通路、影响细胞周期和抑制DNA的生物合成相关。

呋喃二烯；MGC-803细胞；胃癌；细胞凋亡；细胞周期；线粒体膜电位；活性氧

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.006

胃癌是严重威胁我国人民生命健康的恶性肿瘤之一，其死亡率在各类肿瘤中仍居前位。化疗作为晚期胃癌治疗的主要手段，在一定程度上能够延长患者生存期，提高生存率，改善生存质量，但目前仍未有突破性进展［1］。中医学以辨证论治为核心，针对胃癌患者的不同情况辨证用药，在延长患者生存期，提高生存率，改善生存质量，抗肿瘤生长、复发和转移及配合化疗增效减毒等方面有一定作用［2］。因此，中药现代化在治疗胃癌和防治术后复发转移，或是配合化疗增效减毒等均具有重要意义。

呋喃二烯（furanodiene，FDE）又名蓬获术环二烯，是从抗肿瘤中药温莪术油中分离得到的单体主成分。有研究表明，其对多种人肿瘤细胞具有选择性增殖抑制作用［3］。本课题组应用多种肿瘤细胞，观察了FDE体外抑制细胞增殖的活性。结果显示，FDE对人胃癌MGC-803细胞的生长有明显抑制作用。关于FDE对胃癌MGC-803细胞抑制作用及作用机制的研究尚未见报道。因此，本研究对FDE抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖作用及机制进行了研究。

1　材料与方法

1.1药物、细胞、主要试剂和仪器

1.2细胞培养

MGC-803细胞用RPMI 1640培养基（添加10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素混合液）于37℃，5%CO2条件下培养，细胞长至培养瓶85%时传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3MTT法检测细胞存活

将处于对数生长期的MGC-803细胞，调整细胞密度3×107L-1，每孔100 μL，接种于96孔板，24 h后加入100 μL的终浓度分别为46.29，92.59，185.18，370.37和740.74 μmol·L-1的FDE，分别作用24，48 和72 h后，每孔加20 μL MTT（5 g·L-1），继续作用4 h后，弃上清液，并加入DMSO 150 μL溶解反应产物，用酶标仪在490 nm波长处检测吸光度值（absorbance，A490 nm），计算对细胞存活的抑制率。存活抑制率（%）=（A490 nm对照组-A490 nm药物组）/A490 nm对照组）×100%。根据所得的FDE 5个浓度梯度的细胞存活抑制率绘制曲线，计算在3个不同作用时间点下FDE诱导细胞凋亡50%时的浓度，即IC50值。

1.4光学显微镜观察细胞形态

取1×106对数生长期MGC-803细胞接种于6孔板，每孔1 mL。24 h后每孔加入FDE 1 mL，终浓度分别为92.59，185.18和370.37 μmol·L-1，作用24 h后吸出培养液，PBS洗细胞2次，光学显微镜下观察细胞形态。

1.5荧光显微镜下Hoechst33242染色法检测细胞凋亡

取1×106个对数生长期细胞接种于6孔板，24 h后加入不同浓度的FDE（终浓度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后，吸出培养液，PBS洗2次。每孔加入500 μL Hoechst33242染色液，避光孵育30 min后用PBS洗1次，4%多聚甲醛固定15 min，在荧光显微镜下观察拍照。正常的细胞核呈蓝色，凋亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

1.6AnnexinⅤ-FlTC/Pl双染流式细胞仪检测细胞凋亡率

取1×106对数生长期细胞接种于6孔板，加入不同浓度的FDE（终浓度92.59，185.18和370.37 μmol·L-1）作用24 h后收集细胞，PBS洗2次，将细胞重悬于200 μL结合缓冲液中，加入10 μL AnnexinⅤ-FITC，室温避光孵育15 min，加入300 μL结合缓冲液和5 μL PI，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7流式细胞仪检测细胞周期

取1×106对数生长期细胞接种于6孔板，加入终浓度分别为92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集细胞，2000×g离心5 min，PBS洗2次，加入1 mL体积分数为75%的乙醇（-20℃预冷），混匀，4℃过夜固定。2000×g离心5 min，PBS洗3次，加入500 μL PI（终浓度50 mg·L-1）避光20 min后，用流式细胞仪检测细胞周期。

1.8流式细胞仪检测活性氧

取1×106对数生长期细胞接种于6孔板，加入终浓度分别为92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集细胞，2000×g离心5 min，PBS洗2次后重悬，加入DCFH-DA荧光探针，室温下避光染色30 min，离心弃上清，用PBS洗2次，通过流式细胞仪检测荧光强度测定细胞内活性氧水平的变化。

1.9流式细胞仪检测线粒体膜电位

取1×106对数生长期细胞接种于6孔板，加入终浓度分别为92.59，185.18和370.37 μmol·L-1的FDE作用24 h后收集细胞，2000×g离心5 min，用无血清RPMI 1640洗2次，重悬细胞，加入罗丹明123染色液，使其最终浓度为10 mg·L-1，37℃避光孵育30 min后离心，弃去上清液，用PBS洗2次，流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位的变化。

1.10统计学分析

2　结果

2.1FDE对MGC-803细胞存活的抑制作用

随着FDE浓度增加和作用时间的延长，FDE对MGC-803细胞存活的抑制作用增强（表1）。FDE作用24，48和72 h时，IC50分别为347.91，257.41 和101.01 μmol·L-1。

2.2FDE对MGC-803细胞形态和凋亡形成的影响

普通光学显微镜下观察发现，FDE作用24 h，MGC-803细胞出现明显的形态改变，细胞碎裂，染色质浓缩，同时细胞数量较对照组明显减少（图1）。Hoechst33242染色结果如图2显示，细胞对照组细胞呈淡蓝色荧光，可见完整的细胞核。FDE作用24 h后，蓝色荧光明显加深且蓝染细胞数量增多，可见到细胞染色质固缩，细胞核呈致密浓染和碎块状，颜色发白，同时可看到细胞核的边缘化及凋亡小体。

Tab.1 Effect of furanodiene（FDE）on survival of MGC-803 cells detected with MTT assay

Fig.1 Effect of FDE treatment for 24 h on morphologi⁃cal changes of MGC-803 cells（×400）.Morphological chang⁃es were observed under optical microscope.↑：cell debris.

Fig.2 Effect of FDE for 24 h on morphological changes on MGC-803 cells（Hoechst 33242，×400）.Morphological changes　were　observed　underfluorescence　microscope.↑：apoptotic MGC-803 cells.

2.3FDE对MGC-803细胞凋亡的影响

AnnexinⅤ-FITC/PI染色后流式细胞仪检测结果（图3）表明，FDE作用24 h诱导细胞凋亡，与细胞对照组细胞凋亡率（6.3±4.4）%比较，FDE 92.59，185.18和370.37 μmol·L-1组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），分别为（14.1±5.4）%，（31.8± 5.7）%和（36.2±4.2）%（n=3），具有浓度效应关系（r= 0.936，P＜0.05），其中FDE为370.37 μmol·L-1时，细胞凋亡率是对照组的5.76倍。

Fig.3 Effect of FDE for 24 h on apoptosis of MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

2.4FDE对MGC-803细胞周期的影响

如图4和表2所示，FDE作用24 h，MGC-803细胞周期分布发生了明显变化（P＜0.05）。当FDE浓度为370.37 μmol·L-1时，S期细胞所占的百分比增至对照组的1.66倍，表明FDE可使MGC-803细胞阻滞于S期。

Fig.4 Effect of FDE treatment for 24 h on cell cycle of MGC-803 distribution detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Tab.2 Effect of FDE on apoptosis and cell cycle of MGC-803 cells

2.5FDE对MGC-803细胞活性氧水平和线粒体膜电位的影响

表3和图5结果表明，细胞对照组细胞活性氧水平较低，FDE作用24 h后，随着药物浓度增大细胞内活性氧水平升高（r=0.975，P＜0.05），当PDE浓度为370.37 μmol·L-1时，活性氧水平是细胞对照组的1.30倍。表3和图6结果表明，FDE作用24 h PDE诱导细胞凋亡，随着浓度的增加，荧光信号的强度逐渐减弱（P＜0.05），表明线粒体膜电位下降（P＜0.05）。流式检测结果表明，当药物浓度为370.37 μmol·L-1时，对应荧光强度的细胞比例与对照组之比为0.85∶1。

Tab.3 Effect of FDE treatment for 24 h on reactive oxygenspecies（ROS）and mitochodrial membrane potential（MMP）of MGC-803 cells

Fig.5 Effect of FDE treatment for 24 h on intracellular level of ROS　in　MGC-803cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

Fig.6　Effect of FDE treatment for 24 h on MMP in MGC-803 cells detected by flow cytometry.A：cell control；B，C and D：FDE 92.59，185.18 and 370.37 μmol·L-1，respectively.

3　讨论

FDE最初是由日本学者Hikino等［4］从莪术中分离鉴定得到，国内外学者又相继证明FDE还存在于白术［5］、没药［6］和珊瑚［7］中。据报道，FDE具有显著的抑制肿瘤活性，并表现出很强的选择性［8-9］。

本研究使用MTT法分别检测FDE作用24，48 和72 h后对MGC-803细胞存活的影响。结果显示，FDE随着浓度的增加和作用时间的延长，对MGC-803细胞存活有明显的抑制作用。细胞形态观察和Hoechst33242荧光染色可见，FDE对MGC-803细胞凋亡具有诱导作用。通过检测细胞凋亡率、线粒体膜电位、活性氧变化以及细胞周期变化等，进一步研究FDE对MGC-803细胞存活抑制作用的作用机制。结果提示，FDE可以明显诱导MGC-803细胞凋亡，并呈明显的浓度效应关系；可降低线粒体膜电位，提高细胞内活性氧水平，阻滞细胞生长于S期，从而促进MGC-803细胞的凋亡［10］。上述结果提示，FDE可以使MGC-803细胞阻滞于S期，阻止其进入G2期和M期，从而抑制MGC-803细胞的增殖并使其凋亡［11-12］。由此可知，FDE抗肿瘤的作用机制可能是通过作用于DNA合成而诱导MGC-803细胞发生凋亡，使细胞生长停滞于S期，降低肿瘤细胞的增殖活性，推测FDE具有一定的研究开发前景。

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lnduction of furanodiene on apoptosis of human gastric adenocarcinoma MGC-803 cells

GUO Jian-min1，2，CHEN Yu2，3，ZHOU Yun2，3，HAN Zhong1，2，YANG Wei1，2
（1.Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangdong Institute of Applied Bioresources，Guangzhou 510990，China；2.Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co.，Ltd.，Guangzhou 510990，China；3.Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

OBJECTlVE To investigate the effect of furanodiene（FDE），a diterpene derived from the medicinal plant Zedoary，on apoptosis of human gastric cancer MGC-803 cells induced in vitro. METHODS MGC-803 cells were treated with FDE 46.29～740.74 μmol·L-1for 24，48 and 72 h，and the cell viability was detected with MTT assay.Cell morphology was observed by light microscopy and Hoechst33342 staining.Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and cell cycle.Rh123 staining and fluorescence probe DCFH-DA were employed to detect the changes in mitochondrial membrane potential（MMP）and reactive oxygen species（ROS）.RESULTS MTT Results showed that FDE 46.29-740.74 μmol·L-1exhibited significantly higher cytotoxicity to gastric cancer MGC-803 cells. IC50for MGC-803 of 24，48 and 72 h treatment was 347.91，257.41 and 101.01 μmol·L-1，respectively. Treatment with FDE 92.58-370.32 μmol·L-1for 24 h also caused significant morphological changes in MGC-803 cells.AnnexinⅤ-FITC/PI double staining showed that the apoptotic rate increased after FDE 92.58-370.32 μmol·L-1treatment for 24 h（P＜0.05）.FDE enabled MGC-803 cell cycle arrest in S phase.DCFHDA staining showed that FDE resulted in an increase in intracellular ROS levels（P＜0.05）when PDE concentration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.MMP decreased after FDE treatment when PDE concen⁃tration was 370.37 μmol·L-1（P＜0.05）.CONCLUSlON FDE Possesses potent tumor selected toxicity and can induce apoptosis of MGC-803 cells through cell cycle arresting，which is related to inhibition of DNA biosynthesis.

furanodiene；MGC-803 cells；gastric cancer；apoptosis；cell cycle；mitochondrial membrane potential；reactive oxygen species

The project supported by National Science and Technology Major Project（2013ZX09103001012）

YANG Wei，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388

R979.1

A

1000-3002-（2016）03-0215-06

2016-01-12接受日期：2016-02-26）

（本文编辑：齐春会）

国家科技重大专项（2013ZX0910-3001012）

郭健敏（1987-），女，硕士研究生，主要从事新药药理与毒理学研究，E-mail：hihiqinqin@qq.com；杨 威（1978-），男，研究员，主要从事新药药理毒理研究。

杨 威，E-mail：yangwei0719@163.com，Tel：（020）22698388