特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选

杨秀颖，张 莉，杨海光，李 莉，方莲花，杜冠华（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050）

特异性抗肝癌单味中草药提取物的高通量筛选

杨秀颖，张 莉，杨海光，李 莉，方莲花，杜冠华
（中国医学科学院北京协和医学院药物研究所药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室，北京 100050）

目的利用高通量筛选分析技术评价单味中草药提取物对肝癌细胞及成纤维细胞的作用，以期获得具有特异性抗肝癌作用的中草药提取物。方法将242种常用单味中草药分别应用石油醚、乙醇或水进行提取，共获得554个中草药提取物。采用MTT来评价提取物对人肝癌细胞Bel7402和小鼠成纤维细胞NIH3T3存活的作用。结果提取物对人肝癌细胞Bel7402及成纤维细胞NIH3T3生长抑制作用＞50%的样品分别占总样品数的7.4%和14.8%，对2种细胞抑制率同时＞50%的样品占总数的4.4%，对Bel7402抑制率为对NIH3T3抑制率2倍以上且对Bel7402抑制率＞50%的样品占总样品数的1.6%。复筛结果显示，防己乙醇提取物（DF173）对肝癌细胞的细胞毒作用特异性较好，具有良好的量效关系。DF173对Bel7402细胞毒作用IC50为8.27 mg·L-1，对NIH3T3的细胞毒作用IC50为19.48 mg·L-1。结论肿瘤细胞联合正常成纤维细胞筛选评价中草药提取物特异性抗肿瘤作用，有利于发现高效、低毒抗肿瘤中草药提取物。

高通量筛选分析；中草药提取物；抗肝癌药（中药）；Bel7402细胞；NIH3T3细胞；防己

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.010

细胞毒类抗肿瘤药物是通过影响肿瘤细胞的核酸和蛋白质等的结构与功能，发挥抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞死亡等作用。通常细胞毒类抗肿瘤药物对肿瘤细胞和人体正常细胞的选择性较低，可同时杀灭正常分裂的细胞，所以在临床应用时易引起多种毒性反应。因此，研发对肿瘤细胞具有选择性的细胞毒类抗肿瘤药物意义重大。

高通量筛选技术使大规模系统活性研究成为可能，可以达到快速准确了解中草药活性组分及药理作用的目的，并为中草药在肿瘤临床治疗方面提供科学依据。已有研究发现，多种中草药粗提物及其活性成分具有抑制肿瘤生长作用［1-3］，或对抗肿瘤药物有增敏作用［4］。目前细胞毒类抗肿瘤药物的获得主要是通过观察候选药物对肿瘤细胞的生长抑制、杀伤作用等细胞水平筛选方法。通过联合对正常细胞的评价，不仅可以获得对肿瘤细胞更加特异的细胞毒类药物［5］，还可以帮助预测毒性作用。本研究利用本课题组前期建立的常用单味中草药提取物样品库中的样品，结合高通量筛选技术评价了不同溶剂中草药提取物对人肝癌细胞Bel7402及小鼠成纤维细胞NIH3T3的细胞毒作用，获得对肝癌细胞特异性作用的中草药提取物，为进一步发现天然产物活性成分提供依据。

1　材料与方法

1.1药品和试剂

242种常用单味中草药恒温干燥4 h后，粉碎后过20目筛。各取1 kg分别采用5000 mL石油醚、乙醇或水3种不同溶剂进行提取。药材分别采用10倍量溶剂回流提取3次，减压回收溶剂得粗提物，共获得554种中草药提取物。各味中草药提取物用二甲亚砜（DMSO）溶解，然后用生理盐水稀释至1 mg·L-1用于筛选，DMSO在筛选体系中含量＜1%。待筛选的中草药粗提物以10 g·L-1的浓度溶于DMSO中，制成储存液，用无菌生理盐水稀释到相应浓度。

RPMI 1640细胞培养基，美国Gibco公司；标准胎牛血清，美国Hyclone公司；MTT，美国Sigma公司；人肝癌Bel7402细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

1.2仪器

细胞培养箱（Sanyo，日本）；显微镜IX71（Olympus，日本）；SpectraMaxM5酶标仪（Molecular Devices公司，美国）；EDR-384S型自动分液系统（日本）；Costar 96孔微板（Corning Incorporated公司，美国）；Hamilton Microlab®STARplus自动工作站（Hamilton公司，瑞士）。

1.3细胞培养条件

人肝癌Bel7402细胞和小鼠成纤维细胞NIH3T3，均用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养。在37℃，5%CO2培养箱中常规培养，隔天换液，根据细胞生长情况每2～3 d传代1次。

1.4MTT法检测细胞存活

选用对数生长期的Bel7402和NIH3T3细胞，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，接种在96孔培养板中。每孔接种细胞180 μL，细胞数量约为每孔3000个。37℃，5%CO2培养16 h，加入待测样品。

样品处理孔加入20 μL相应浓度药物，细胞对照则加20 μL生理盐水（含0.1%DMSO），另设含同等体积培养基的空白对照组孔。细胞用样品处理72 h后，弃去上清液，每孔加入100 μL新鲜配制的MTT（5 g·L-1）无血清培养液，37℃继续培养4 h。培养结束后，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡。在酶标仪上490 nm波长处测定吸光度值（A）。计算细胞存活抑制率（%）。细胞存活抑制率（%）=（A细胞对照-A药物）/（A细胞对照-A空白对照）×100%。

1.5统计学分析

2　结果

2.1中草药提取物对人肝癌细胞Bel7402存活的影响

中草药提取物与人肝癌细胞Bel7402共同作用。结果表明，终浓度为0.1 g·L-1时，多种中草药提取物对人肝癌细胞系Bel7402具有细胞毒作用，其中抑制率＞50%的提取物约占总样品数的7.4%，抑制率＞80%的样品占2.2%（图1）。

2.2中草药提取物对小鼠成纤维细胞NlH3T3存活的影响

Fig.1　Effect of 554 traditional Chinese medicine （TCM）extracts on viability of human hepatocellular carcinoma cells（Bel7402）.A：scatter；B：floating column. Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curve of 554 samples；line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

中草药提取物与小鼠成纤维细胞NIH3T3共同作用。结果表明，在0.1 g·L-1的终浓度下，多种中草药提取物对小鼠成纤维细胞NIH3T3具有细胞毒作用，其中抑制率＞50%的提取物约占总样品数的14.8%，抑制率＞80%的样品占4.5%（图2）。

2.3中草药提取物对细胞Bel7402和NlH3T3存活作用的比较

初筛结果显示，对NIH3T3表现为高细胞毒作用的样品较对Bel7402细胞样品多。大部分对Bel7402细胞具有细胞毒作用的样品，同时对NIH3T3细胞也有细胞毒作用（图3A）。对NIH3T3和（或）Bel7402细胞毒作用＞50%的中草药提取物共99个，占总数的17.4%。而对Bel7402和NIH3T3细胞同时具有细胞毒作用的样品占总数的4.4%。对Bel7402的细胞毒作用＞50%且抑制率为NIH3T3细胞2倍以上样品占总样品数的1.6%（图3B）。

2.4具有抗癌活性样品复筛及特异性作用评价

选取对Bel7402细胞毒作用强度与NIH3T3比率＞2的样品进行复筛，结果显示，样品防己乙醇提取DF173具有较好的重复性和良好的量效关系。DF173对肝癌细胞Bel7402和成纤维细胞NIH3T3的细胞毒作用IC50分别为8.27和19.48 mg·L-1。此药的细胞毒的效力在肝癌细胞中作用明显强于成纤维细胞株（图4）。

Fig.2 Effect of 554 TCM extracts on viability of fibro⁃blast cells（NlH3T3）.A：scatter；B：floating column.Lines a and c represent the accumulated inhibitory rate distribution curves of 554 samples；line b represents an approximate normal inhibitory rate distribution curve of 554 samples.

Fig.3　Comparison of TCM extraction on viability of Bel 7402 and NlH3T3 cells.A：the merged column graph of inhibitory rate of 554 samples in human hepatocellular carcinoma cells Bel 7402 and mouse fibroblast cells NIH3T3.B：the scatter curve of inhibitory rate above 50%of samples in Bel 7402 cells and/or NIH 3T3 cells.

Fig.4 The concentration-response curves of DF173 on inhibitory rate in Bel7402 cells and NlH3T3 cells.，n=3.**P＜0.01，compared with NIH 3T3 control.

3　讨论

本研究采用人肝癌细胞Bel 7402，并利用小鼠成纤维细胞NIH3T3作为正常细胞对照，对常用的242种单味中草药的不同极性溶剂提取物抗肝癌作用进行了高通量筛选。结果显示，在0.1 g·L-1的浓度下，约14.8%的中草药提取物样品对成纤维细胞生长抑制作用达到50%以上，反映了中草药粗提物的成分比较复杂，虽存在一定细胞毒作用，但特异性相对较差。

以往报道中草药中具有细胞毒活性的化学成分类型广泛，包括挥发油、生物碱、萜类和内酯等，其作用机制和途径也不尽相同［6-7］。目前临床抗肝癌治疗中，应用中草药及其提取物抗肝癌治疗比较广泛，药理作用一般为抑制肿瘤细胞生长、逆转耐药性及增强机体免疫力等。本研究采用MTT方法简单、快速，是应用最为广泛的抗肿瘤作用评价模型之一，但该模型提供的信息有限。同时考察药物对正常细胞的细胞毒作用及作用强度，可以为发现作用更加特异、对人体毒性更低的抗肝癌中草药提取物提供线索。但因现有的成纤维细胞株也具有无限繁殖的特性，因此其作为正常细胞使用仍然具有相对性。对可持续增殖的正常细胞株界定及开发，仍需要进一步研究。

本研究发现，防己乙醇提取物DF173对肝癌细胞细胞毒作用特异性相对较强。而对成纤维细胞NIH3T3细胞毒作用较低。提示DF173提取物可能在肝癌治疗中具有高特异和低毒的特性。防己及其主要成分汉防己甲素（tetrandrine）具有抗肿瘤作用［8-9］，防己的醇溶性提取物中有汉防己甲素。还有研究显示，汉防己甲素具有促进肝癌细胞Bel7402凋亡的作用［9］。本研究结果与该文献报道相符。

传统筛选模式是只针对肿瘤细胞的细胞毒筛选模式，选择性较低。肿瘤细胞联合正常成纤维细胞，筛选评价中草药提取物特异性抗肿瘤细胞毒作用，将有利于发现高效、低毒的抗肿瘤药物。

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High-throughput screening of single Chinese plant extracts on specific anti-hepatoma drugs

YANG Xiu-ying，ZHANG Li，YANG Hai-guang，LI Li，FANG Lian-hua，DU Guan-hua
（Beijing Key Laboratory of Drug Target Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

OBJECTlVE To evaluate the effect of single traditional Chinese medicine（TCM）herb extracts on hepatoma and normal fibroblast cells using high-throughput screening in order to obtain extracts with specific anti-hepatoma effect.METHODS 242 commonly used TCM herbs were extracted by petroleum ether，ethanol and water，respectively.The total number of TCM extracts was 554.The cyto⁃toxicity of samples was evaluated by MTT in human hepatoma cells Bel7402 and mice normal fibroblasts NIH3T3.RESULTS 7.4%of the total extracts had an inhibitory effect greater than 50%for Bel7402，but 14.8%for fibroblasts NIH3T3 cells.Extracts with an inhibitory effect above 50%on both Bel7402 and NIH3T3 cells accounted for 4.4%of the total extracts.Our results showed that the sample DF173 had preferable cytotoxicity effect on hepatoma carcinoma cells in a good dose-effect relationship.DF173 is an ethanol extract from Stephania tetrandra，which is a commonly used herb in TCM.The cytotoxic IC50of DF173 against Bel7402 was 8.27 mg·L-1，and 19.48 mg·L-1on NIH3T3.CONCLUSlON The componentsof TCM herbs are highly complicated.The combination of tumor cells with normal fibroblast cells to evaluate the cytotoxicity effect during anti-tumor drug screening will contribute much to the discovery of TCM drugs with high anti-tumor efficiency and lower toxicity.

high-throughput screening assays；plant extracts，Chinese；anti-hepatoma drugs （TCM）；Bel7402 cells；NIH3T3 cells；Stephania tetrandra

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81470159）；and National Science and Technology Major Projects for″Major New Drugs Innovation and Development″（2013ZX09508104）

DU Guan-hua，E-mail：dugh@imm.ac.cn，Tel：（010）63165184

R965.1，R285

A

1000-3002-（2016）03-0243-05

2015-11-23接受日期：2016-01-30）

（本文编辑：乔 虹）

国家自然科学基金（81470159）；国家科技重大专项（2013ZX09508104）

杨秀颖，女，博士，副研究员，主要从事药理学、新药药物筛选研究；杜冠华，男，研究员，博士生导师，主要从事药理学、新药药物筛选研究。

杜冠华，E-mail：dugh@imm.ac.cn，Tel：（010）63165184