穿心莲内酯及水溶性衍生物致HK-2细胞毒性筛选及亚硫酸氢钠穿心莲内酯相对毒性机制

谷丽丽，邢文敏，王一奇，郑晓亮，陆　红（.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 30053；.浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州 3003）

穿心莲内酯及水溶性衍生物致HK-2细胞毒性筛选及亚硫酸氢钠穿心莲内酯相对毒性机制

谷丽丽1，邢文敏1，王一奇1，郑晓亮2，陆红1
（1.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053；2.浙江省医学科学院药物研究所，浙江杭州 310013）

目的 观察和比较穿心莲内酯及其水溶性衍生物〔亚硫酸氢钠穿心莲内酯（ASB）、穿琥宁和炎琥宁〕的原料药对人肾小管上皮细胞HK-2的毒性作用，探讨ASB所致内质网应激作用机制。方法 MTT法检测分别给予4种药物作用后HK-2细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50）。ASB给药组采用Hoechst33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡；检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；Western蛋白质印迹法检测免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）和胱天蛋白酶4的表达。结果 4种药物在一定浓度下均能抑制HK-2细胞增殖，呈时间和浓度依赖性。药物作用24 h，穿心莲内酯IC50为30.6 μmol·L-1，均比其他衍生物小，而穿琥宁和炎琥宁的IC50（分别为16.2和15.6 mmol·L-1）相差不大，ASB的IC50为29.4 mmol·L-1。在ASB（0，15，30和60 mmol·L-1）处理24 h后，细胞凋亡率上升，SOD活性下降，MDA含量上升，均呈现浓度依赖性。与对照组比较，8 h时，ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP表达水平增加（P＜0.01），Bip和胱天蛋白酶4蛋白无显著变化。另外，24 h时，ASB（60 mmol·L-1）组Bip蛋白水平减少（P＜0.05），ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP蛋白表达增加（P＜0.01）；活化的胱天蛋白酶4随ASB浓度升高表达增加（P＜0.01）。结论 穿心莲内酯及其水溶性衍生物对HK-2细胞具有一定毒性作用，内质网应激相关的CHOP和胱天蛋白酶4通路参与了ASB诱导的细胞凋亡。

穿心莲内酯；水溶性衍生物；肾毒性；内质网应激；HK-2细胞

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2016.03.008

穿心莲内酯（andrographolide，AD）是从爵床科植物穿心莲〔Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees〕的全草或叶提取的主要有效成分，因其水溶性差，难以满足临床上病毒感染急症的需求。为此，将其结构中引入不同的亲水基团，开发了一系列注射剂，如莲必治、穿琥宁和炎琥宁注射液，其主要成份分别为亚硫酸氢钠穿心莲内酯（androgra⁃pholide sodium bisulfite，ASB）、14-脱羟-11，12二脱氢穿心莲内酯-3，19-二琥珀酸半酯单钾盐（potassium dehydroandrographolide succinate，PDS）和14-脱羟-11，12-二脱氢穿心莲内酯-3，19-二琥珀酸半酯钾钠盐（potassium sodium dehy⁃droandrographolide succinate，PSDS）占据市场主导地位［1-3］。国家药品不良反应监测中心《药品不良反应信息通报》第8期和第23期因严重不良反应分别对莲必治注射剂、炎琥宁注射剂和穿琥宁注射剂发出安全警示［4-7］。穿琥宁注射剂血液系统不良反应发生率高，莲必治注射剂肾损害发生率高，其不良反应多由细胞毒性引起［8-9］。穿心莲内酯类药物毒性已经成为制约其现代化和临床应用的重要障碍。

课题组前期在整体动物水平，对ASB和PDS的肾毒性进行了研究，ASB以1000 mg·kg-1（相当于临床等效剂量的6倍）给予小鼠和500 mg·kg-1给予家兔，对其肾产生一定毒性［10］。PDS（1000和2000 mg·kg-1）同样引起小鼠肾节段性小管上皮细胞肿胀变性，其毒性机制可能与HK-2细胞凋亡有关［11］。体外研究表明，ASB作用于人近端肾小管上皮细胞（HK-2）后，诱导大量活性氧产生，活化c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信号通路，通过胱天蛋白酶依赖的线粒体途径诱导细胞凋亡［12］。另外，JNK是联系内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与细胞凋亡的重要中间信号分子［13］。新近研究发现，ERS与多种肾毒物引发的肾损伤机制密切相关［14］，而穿心莲内酯类衍生物与ERS相关的作用机制也未见报道。因此，本研究在前期基础上，就AD及其水溶性衍生物ASB，PDS和PSDS的肾毒性进行了体外实验筛选，并探讨ERS是否也参与ASB诱导的细胞凋亡。

1　材料与方法

1.1试剂和仪器

AD（98%，批号：MKBN8939V）和四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyltetrazolium，MTT，批号：822A054），均购于美国Sigma公司；PDS（类白色结晶性粉末，含量＞99%，批号：20141129）和PSDS（白色粉末，含量＞94%，批号：20141204），均购于湖北枣阳臻远化工有限公司；ASB（白色粉末，纯度＞99%，批号：20140501），购于浙江九旭药业有限公司；DMEM/F12培养基（批号：14031003）和磷酸盐缓冲液（PBS，批号：14030607），均购于杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清（批号：130126），购于杭州四季青生物工程材料有限公司；Hoechst33342染色液（批号：C1025）、AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号：C1063）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒（批号：S0101）、丙二醛（malondialde⁃hyde，MDA）检测试剂盒（批号：S0131）和二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012）均购于碧云天生物技术有限公司；增强子结合蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）（L63F7）鼠抗（#2895）（1∶1000）、免疫球蛋白重链结合蛋白（binding immunoglobulin protein，Bip）（C50B12）兔抗（#3177）（1∶1000）和胱天蛋白酶4兔抗（#4450）（1∶1000），均购于美国CST公司；β肌动蛋白（C4）（批号：sc-47778）（1∶500），购于美国Santa Cruz公司；HRP-山羊抗小鼠lgG（批号：BL001A）（1∶5000），购于Biosharp公司；HRP-山羊抗兔lgG（批号：BA1054）（1∶2000），购于博士德生物公司。

UNIVERSAL320/320R台式（常温/冷冻）离心机（德国，Hettich），多功能酶标仪（美国，Thermo Scientific），HEPA CLASS100型细胞CO2培养箱（美国，Thermo），GuavaeasyCyte流式细胞仪（德国，Merck），Ti-U荧光倒置显微镜（日本，Nikon公司），Mini-PROTEAN165-8004电泳仪（美国，Bio-Rad公司）。

1.2细胞培养

HK-2细胞购自中国医学科学院细胞中心（来源于美国ATCC），用含10%胎牛血清的DMEM∶F12 （1∶1）培养基培养，置于37℃，5%CO2及饱和湿度的恒温培养箱中培养，每2～3 d换液一次，培养使细胞融合至80%以上，倒置显微镜观察细胞生长情况，传代培养，取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT法检测细胞存活率

细胞以2×107L-1的密度接种于96孔板内，培养至细胞融合度达70%～80%，吸弃旧培养液，分别加入不同浓度AD，终浓度为0（培养液对照），10，30，60，100和150 μmol·L-1，同时设空白对照组（只加等体积的培养液，不加细胞，用于检测本底），每孔加入0.1 mL，每组设3复孔，分别作用8，16，24和48 h，随后每孔加20 μL MTT溶液（5 g·L-1），继续培养4 h，倾弃培养液，每孔加入DMSO 0.15 mL，振荡10 min使结晶物充分溶解，用酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度（A）值，计算细胞存活率，细胞存活率（%）=（A待测药物-A空白对照）/（A培养液对照-A空白对照）×100%。实验数据用Graphpad prism 5软件作图并计算半数抑制浓度（IC50）值。ASB，PDS 和PSDS同样处理。

1.4Hoechst33342染色法检测细胞核形态

细胞以5×107L-1的密度接种于6孔板中，当细胞融合度达70%～80%，加入ASB（0，15，30和60 mmol·L-1），作用24 h后用PBS洗涤，按Hoechst33342染色液说明书操作，荧光显微镜下观察细胞核形态变化。

1.5AnnexinⅤ/Pl双染流式细胞术检测细胞凋亡率

细胞培养同1.4，收集6孔板中不同组别的细胞，用PBS洗涤2次，取（5～10）×104重悬的细胞，离心（1000×g，室温）5 min，弃去上清。按AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明操作，加入荧光溶液，混匀。避光孵育，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6MDA含量的测定

细胞以1×109L-1的密度接种于25 cm2培养瓶中，加入含有不同浓度ASB（0，15，30和60 mmol·L-1）的培养基，作用24 h后收集各组细胞，用4℃预冷的PBS洗涤1～2遍，按MDA检测试剂盒说明书操作，实验重复3次。测得各组样品溶液中的MDA含量。

1.7SOD酶活性的测定

细胞样品前处理同1.6，随后按SOD活性检测试剂盒说明书操作，根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活性单位为kU·g-1蛋白。

1.8Western蛋白印迹法检测Bip，CHOP和胱天蛋白酶4的表达

HK-2细胞分别与不同浓度ASB（0，15，30和60 mmol·L-1），作用8或24 h后，用细胞裂解液将细胞裂解，取上清，采用BCA法测定蛋白浓度，取20 μg蛋白样品经12%SDS-PAGE电泳和转印，用Bio-Rad凝胶成像系统进行图像采集，Image J软件分析各组条带的积分吸光度值（integrated absorbance，IA），蛋白的相对表达水平用β肌动蛋白的表达校正，即目的蛋白相对表达量=IA目的蛋白/ IAβ肌动蛋白。具体方法参照文献［15］进行。

1.9统计学分析

2　结果

2.1穿心莲内酯及3种水溶性衍生物对细胞存活率的影响

如图1所示，分别给予AD（0～150 μmol·L-1），ASB（0～75 mmol·L-1），PSDS（1～20 mmol·L-1）和PDS（0～8 mmol·L-1）作用于HK-2细胞8，16，24和48 h后，细胞存活率随药物浓度升高逐渐降低。如表1所示，在给药24和48 h时，AD的IC50最低，ASB的IC50最高。

2.2ASB对细胞形态和凋亡率的影响

如图2所示，Hoechst33342染色随ASB药物浓度的升高，胞核或胞质内浓染致密的蓝色荧光颗粒清晰可见，细胞数目减少，凋亡细胞皱缩变小，形态大小不一，部分细胞核碎裂。在给予ASB（0，15，30和60 mmol·L-1）作用24 h后，凋亡细胞百分率以浓度依赖性增加，依次为（10.7±3.7）%，（14.4±4.0）%，（28.1±2.1）%和（35.3±5.4）%。与正常对照组相比，ASB 30和60 mmol·L-1组细胞凋亡率明显增加（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.1 Effect of andrographolide（AD）（A），andrographolide sodium bisulfate（ASB）（B），potassium sodium dehy⁃droandroandrographolide succinate（PSDS）（C）and potassium dehydroandrographolide succinate（PDS）（D）on viability of HK-2 cells by MTT assay.，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01，compared with 0 μmol·L-1group.

Tab.1　lC50value of four drugs at 24 and 48 h

Fig.2 Effect of ASB on apoptosis of HK-2 cells（×200）. Cells were treated with ASB for 24 h，stained with Hoechst33342.

2.3ASB对HK-2细胞内氧化应激的影响

如表2所示，在ASB处理24 h后，SOD酶活性下降，而MDA含量上升，两者均呈现浓度依赖性（r=-0.8654，P＜0.01；r=0.8890，P＜0.05），且ASB 30和60 mmol·L-1组与对照组比较有显著差异（P＜0.05，P＜0.01）。

Tab.2　EffectofASB　on　superoxidedismutase （SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content in HK-2 cells

2.4ASB对HK-2细胞内质网分子伴侣Bip，CHOP和胱天蛋白酶4表达的影响

Fig.3 Effect of ASB on relative expression levels of endoplasmic reticulum stress representative proteins in HK-2 cells by Western blotting.Cells were treated with ASB（0，15，30 and 60 mmol·L-1）for 8（A1 and A2）and 24 h（B1 and B2），respectively.，n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 compared with ASB 0 mmol·L-1group.

如图3A所示，ASB作用于HK-2细胞8 h时，Bip蛋白表达无显著差异；ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP蛋白表达增加（P＜0.01）。如图3B所示，ASB作用于HK-2细胞24 h时，ASB 60 mmol·L-1组Bip蛋白表达减少（P＜0.05）；ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP蛋白表达增加（P＜0.01）；胱天蛋白酶4的酶原（pro-caspase 4）分子质量是45 ku，而分子质量为32 ku cleaved胱天蛋白酶4是其活化形式［16］，ASB组细胞在8 h时，胱天蛋白酶4开始发生剪切，但无明显差异；24 h时活化的胱天蛋白酶4随ASB（15，30和60 mmol·L-1）浓度升高表达增加（P＜0.01）。

3　讨论

本研究结果表明，各药物在不同浓度对HK-2细胞有不同程度毒性损伤作用，并呈现一定浓度和时间依赖性；并且发现在给药24 h时，与其他3个衍生物相比，AD的IC50值（30.6 μmol·L-1）最小，提示AD对肾细胞具有较强的毒性作用。但文献报道，在急性毒性实验中，AD未见明显的毒性［17］，这可能由于体内外环境差异较大所致。AD在体内经吸收代谢，ASB是其代谢产物之一［18］。莲必治注射液引起的急性肾功能损伤临床报道较多，说明AD在体内代谢生成ASB甚微，是AD不足以引起肾毒性的原因之一；同时提示，在对AD进行结构改造、获得药效较好的衍生物的同时，应注意考察其毒性作用。

ASB作为临床上典型的AD水溶性衍生物致肾毒性的代表，本研究重点对其肾毒性机制进行探讨。将ASB作用于HK-2细胞后，细胞形态受到不同程度破坏，细胞凋亡率上升，细胞内MDA含量上升，SOD酶活性降低，这与胡中慧等［19］对其急性肾毒性机制的研究结果相似，即ASB通过干扰HK-2细胞线粒体能量代谢，改变细胞内氧化还原状态，使细胞内活性氧大量堆积，进而引发细胞凋亡或坏死。本课题组前期运用蛋白质组学技术分析了肾和肾线粒体的蛋白质组，发现氧化应激参与ASB诱导的肾毒性［20-21］。据文献报道，氧化应激也参与了ERS的发生发展［22-23］。ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路。ERS早期出现未折叠反应，内质网伴侣分子Bip正常状态下与内质网跨膜蛋白结合，而氧化应激时将分离，转而去应付未折叠蛋白，进而被耗竭［24］。未折叠反应主要作用是通过暂时抑制蛋白质翻译，增加内质网内具有折叠能力蛋白的基因转录而减少内质网内的蛋白负担，对细胞损伤具有保护作用［25］，然而当应激持续过强，Bip含量减少，ERS保护机制不能与损伤抗衡，细胞适应性反应失控将诱导细胞凋亡。CHOP是ERS特异的转录因子，在非应激状态下，它的表达水平很低，而在ERS中，表达量增加，最终通过激活胱天蛋白酶3从而诱导细胞凋亡。CHOP激活被认为是ERS促发细胞凋亡最重要的信号途径［26］。此外，胱天蛋白酶12仅产生于内质网，是内质网膜上的组成性蛋白，胱天蛋白酶4属于人源性，是胱天蛋白酶12的同源体。ERS发生时，胱天蛋白酶12经过特定位点裂解激活，从内质网转运到胞浆，在胞浆激活胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3等，最终引发细胞凋亡［27］。

本研究结果表明，当ASB作用HK-2细胞24h 后CHOP蛋白表达增加，胱天蛋白酶4活化，提示除线粒体途径外，ERS可能参与了ASB诱导的肾毒性，介导细胞凋亡。ERS是由各种生理病理刺激，通过复杂信号的关联而引发。为了进一步明确ERS的作用，本课题组将对ASB同一浓度下不同时间点Bip蛋白的变化，以及与Bip结合的内质网跨膜蛋白水平变化进行探索，建立ERS前后期的联系，并通过干预ERS是否减少ASB诱导的细胞凋亡进行探讨。

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Toxicity screening of andrographolide and its watersoluble derivatives on HK-2 cells and relative toxicity mechanism induced by andrographolide sodium bisulfite

GU Li-li1，XING Wen-min1，WANG Yi-qi1，ZHENG Xiao-liang2，LU Hong1
（1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Institute of Pharmacology，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China）

OBJECTlVE To observe and compare the cytotoxicity induced by andrographolide （AD）and its water soluble derivatives：andrographolide sodium bisulfite（ASB），active pharmaceutical ingredients of Chuanhuning and Yanhuning on human renal tubular epithelial cells（HK-2），and to explore the ASB-induced endoplasmic reticulum stress（ERS）mechanism.METHODS HK-2 cells were treated with the above four drugs respectively.The survival rate was examined by methyl thiazolyltetrazolium （MTT）assay and 50%inhibitory concentration（IC50）was calculated.In ASB treated group，Hoechst33342 staining and flow cytometry analysis were used to determine cell apoptosis，intracellular superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content were examined，and the protein expressions of binding immunoglobulin protein（Bip），C/EBP-homologous protein （CHOP）and cysteine-containing aspartate-specific protease 4（caspase 4）were detected by Western blotting.RESULTS The four drugs inhibited HK-2 cell growth in a time-dependent and concentrationdependent manner.At 24 h，the IC50of AD（30.6 μmol·L-1）was lower than that of others.Active pharmaceutical ingredients of Chuanhuning and Yanhuning（16.2 and 15.6 mmol·L-1）were very close，ASB was 29.4 mmol·L-1.ASB（0，15，30 and 60 mmol·L-1）increased the apoptotic rate and caused the decrease in SOD activity and the increase in MDA content in a dose-dependent manner. Compared with control group，the protein expression of CHOP increased（P＜0.01）at 8 h with ASB （30 and 60 mmol·L-1）treatment，Bip and caspase 4 had no significant change.In addition，at 24 h，ASB（60 mmol·L-1）decreased the expression of Bip（P＜0.05），ASB（30 and 60 mmol·L-1）promoted the expression of CHOP（P＜0.01），and the protein expression of activated caspase 4 increased in a concentration-dependent manner（P＜0.01）.CONCLUSlON AD and its water soluble derivatives have a toxic effect on HK-2 cells.CHOP and caspase 4 pathway related to ERS is involved in ASB-induced apoptosis.

andrographolide；water-soluble derivatives；renal toxicity；endoplasmic reticulum stress；HK-2 cells

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81173650）；and Medical Science and Technology Project of Zhejiang Province（2012ZA027）

LU Hong，Tel：（86）13157129893，E-mail：luhong03@hotmail.com

R285.1

A

1000-3002-（2016）03-0229-07

2015-11-17接受日期:2016-01-25）

（本文编辑：沈海南）

国家自然科学基金项目（81173650）；浙江省中医药科研基金（2012ZA027）

谷丽丽（1990～），女，硕士研究生，从事中药药效及毒理学研究；陆 红（1968～），硕士，教授，从事中药药效及毒理学研究。

陆 红，E-mail：luhong03@hotmail.com，Tel：13157129893