念珠菌生物被膜和抗真菌药物选择

李建国

·综述·

念珠菌生物被膜和抗真菌药物选择

李建国

念珠菌； 生物被膜； 抗真菌药物； 耐药机制

由于各种高效广谱抗菌药物的广泛使用，病原微生物产生了多种耐药机制以保持物种的延续，而形成生物被膜就是一种重要的耐药机制［1-2］。生物被膜是指大量微生物黏附于某些物体的表面形成的一种膜样聚集，具有复杂的三维结构和功能［2］。随着现代医学的发展，人体植入物和移植物的应用越来越广泛，病原微生物可附着于植入性医疗器材（如各种人工假体、支架、血管内插管、各种类型导管等）的表面形成生物被膜，逃避宿主的免疫防御并抵制抗菌药物的作用，目前认为人体80%微生物感染与病原微生物的生物被膜相关［3］。

念珠菌属是人体内最大的正常真菌菌群，广泛定植于机体与外界相通的各个器官，包括口咽部、鼻咽部、胃肠道、前尿道和阴道等部位［4］。念珠菌属是造成人类侵袭性真菌感染最常见的条件致病真菌，73.4%侵袭性真菌感染由念珠菌引起［5］。可导致感染的念珠菌超过17种，其中90%以上的感染由白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌引起，而白念珠菌就造成超过60%的感染［6］。念珠菌所致感染类型广泛，从并不危及生命的皮肤黏膜感染，到多脏器的侵袭性感染［7］。念珠菌极易在各种植入性器材表面形成生物被膜，在人体免疫功能低下时造成机体感染，从而导致念珠菌血流感染及其他各种危及生命的侵袭性念珠菌病，病死率高达30%［8］。

生物被膜相关性感染会影响患者预后，临床研究表明由产生生物被膜念珠菌造成的念珠菌血流感染其致死率是由不产生生物被膜念珠菌造成的血流感染的1.77倍［9］，生物被膜产生也是念珠菌血流感染患者死亡的独立危险因素［10］。动物实验也表明，从生物被膜扩散的游离念珠菌较非生物被膜游离念珠菌具有更强的毒力，从而其感染可造成更差的结局［11］。生物被膜相关性感染很难控制，因为其具有更强的耐药性，普通抗真菌药物治疗很难完全清除生物被膜［1］。目前临床对念珠菌生物被膜尚无理想对策，一旦发生，只能取出植入器材，而这同样严重影响患者预后［1］。如何防治和克服生物被膜耐药问题，已成为临床上极具挑战性的课题。

1 念珠菌生物被膜的形成与耐药机制

生物被膜是由微生物自身分泌的胞外多聚基质包裹的微生物聚集体，其中90%以上的干物质为胞外聚合物［2］。胞外多聚基质主要由胞外多糖、蛋白、核酸和脂类物质组成，形成稳定三维结构支架，介导生物被膜附着于物体表面［2］，为微生物生长提供一个相对稳定、安全的微环境［3］。一般生物被膜形成有以下步骤：①微生物附着于物体表面；②形成离散菌群结构；③分泌胞外多聚基质，形成成熟三维结构；④生物被膜微生物聚合体扩散形成子代生物被膜［12］。体外研究表明，白念珠菌生物被膜形成要经过3个阶段：①早期（约0～11 h）：大部分白念珠菌细胞以芽生孢子的形式黏附于生物材料表面并形成明显菌落；②中期（约12～30 h）：细胞分泌胞外多聚基质覆盖在菌落表面，形成由孢子、胚芽管和新菌丝样细胞组成的双层结构；③成熟期（约38～72 h）：细胞外多聚基质包裹着芽生孢子和菌丝细胞组成网状结构，厚度在2～450 μm［12］。念珠菌生物被膜在动物体内形成也有类似步骤，只是厚度一般都超过100 μm［13］。

生物被膜的形成受附着基底层、营养、唾液或血液、可使用氧浓度、胞外多聚基质和念珠菌种属等多种因素的影响［14］。很多材料如有机硅支架、有机玻璃、塑料和玻璃表面都可以形成生物被膜，这些材料的理化性质影响白念珠菌附着和生物被膜的形成。以葡萄糖、果糖或乳糖为碳源比蔗糖和麦芽糖更容易形成白念珠菌生物被膜。而一般植入物直接与身体体液，如唾液或是血液接触后，会直接裹上一层薄膜，可能影响生物被膜形成。尽管念珠菌在有氧、无氧条件下均能生长，念珠菌生物被膜形成是否也如此目前尚无定论。胞外多聚基质的形成与营养流动相关，流动营养比静止营养更容易增加胞外多聚基质的合成。不同念珠菌种属形成的生物被膜也有差别，野生菌比实验室菌形成的生物被膜更“健康光滑”。生物被膜具有高度耐药性的特异表型，其耐药浓度可以比单个个体微生物高1 000倍，其耐药机制主要有：①生物被膜内细胞高密度导致细胞生长速率降低，代谢活性降低，对抗真菌药物不敏感；②生物被膜胞外多聚基质的保护作用，阻碍药物进入细胞发挥作用；③生物被膜细胞大量表达外排泵蛋白等与耐药相关的蛋白；④一些抗真菌药物靶点细胞膜麦角固醇表达降低；⑤滞留菌（persister cells）形成核心亚群抵抗真菌药物；⑥生物被膜压力应激反应。

1.1 细胞密度、群体感应和生长速率

生物被膜内细胞密度高也可能是其耐药机制之一。研究表明高细胞密度比低细胞密度具有更高的耐药性，而且生物被膜重新分散后，高密度细胞也比低密度细胞耐药性更高［15］。白念珠菌有两个功能相反的群体感应分子：酪醇和法尼醇，体外法尼醇可以和多种抗真菌药物如氟康唑、两性霉素B和米卡芬净协同作用抗念珠菌生物被膜［16］。有些研究者还认为生物被膜内细胞密度太高，得不到充分的营养而导致的细胞生长速率低下可能引起其耐药，这一观点已经在一些细菌生物被膜中被证实［1］。不过有研究表明生物被膜内和游离培养的细胞生长速率并没有差异［12］，而且，不同生长速率的生物被膜细胞对两性霉素B的耐药性比较一致，表明念珠菌生物被膜的耐药性可能与细胞生长速率无关［17］。

1.2 胞外多聚基质的作用

念珠菌形成的成熟生物被膜中胞外基质厚达450 μm，一些研究者认为，这些胞外基质可以通过形成物理屏障阻止抗菌药物进入细胞内而产生耐药作用［3］。有研究表明除去念珠菌生物被膜外基质后再用两性霉素B处理，膜内真菌细胞的生存率降低20%，而且结果表明热带念珠菌生物被膜胞外多聚基质厚度与其耐药程度相关［18］。生物被膜基质可以隔离放射性标记的氟康唑，这种耐药机制可能与基质中的β-1，3-葡聚糖有关［19］。而且生物被膜可以与两性霉素B、氟胞嘧啶和棘白菌素类药物相互作用从而表现出耐药性［20-21］。生物被膜胞外基质中的DNA也会影响其耐药性，白念珠菌生物被膜用DNA酶处理后可以提高其对棘白菌素类和多烯类药物的敏感性，但是不影响对氟康唑的敏感性［22-23］。

1.3 外排泵蛋白高表达

外排泵相关蛋白高表达可以将药物排出细胞外，降低细胞内的抗菌药物浓度。在无抗菌药物存在时，ATP结合盒转运蛋白CDR1和CDR2与易化扩散超家族转运蛋白MDR1表达水平都很低［24］，但在形成生物被膜时其表达明显升高，可能是白念珠菌对唑类药物耐药的机制之一［25］。单基因或双基因敲除突变株（CDRl，CDR2，MDR1， CDRl/ CDR2，MDR1/CDRl）在游离状态下对氟康唑的敏感性增高，但形成生物被膜之后仍具有较高的耐药性［25］。通过多基因敲除菌株实验表明，在生物被膜形成早期（6 h），与无突变菌株相比，双敲除或三敲除菌株形成的生物被膜对氟康唑敏感性明显增加，但是在中后期（12、48 h），野生株和基因敲除株形成的生物被膜对氟康唑的敏感性没有差异，表明生物被膜形成不同阶段外排泵基因的表达有所差异，外排泵主要在生物被膜形成早期起作用［26］。

1.4 甾醇合成的影响

唑类药物抗真菌的作用机制是抑制真菌细胞膜成分麦角固醇的生物合成，而两性霉素B也是通过与细胞膜上的麦角固醇结合发挥作用，因此，甾醇合成变化也是念珠菌耐药机制之一。研究表明，生物被膜在形成过程中细胞膜麦角固醇含量显著降低，尤其是在中后期，其含量比早期下降了近50%［26］。因此成熟生物被膜对麦角固醇靶向药物具有较好的耐药性。还有研究表明生物被膜形成不同阶段甾醇合成相关基因转录水平明显变化［27］。ERG11编码羊毛甾醇14α去甲基酶是唑类药物的作用靶点，ERG25编码C4甲基甾醇氧化酶，参与甾醇中间体合成，芯片分析表明ERG25 和ERG11在念珠菌体外生物被膜形成过程中转录水平升高，ERG25转录水平在体内生物被膜形成过程中也显著升高［28］。

1.5 滞留菌

滞留菌是菌群中所占比例不到0.1%的一类表型异化的亚群，具有与种群内普通菌、抗性突变菌所不同的特征，可通过“休眠-生长-增殖”应对逆境的胁迫，维持自身生存和菌体结构稳定［29］。其生长速度不如正常生物被膜细胞，但能够在高浓度抗菌药物下存活并且形成菌落［30］，药物撤除之后，这些滞留菌可形成新的生物被膜［31］。这些细胞和野生株在甾醇和β-1，6-葡聚糖相关基因转录上有差异［32］。研究显示，在不同种念珠菌形成的生物被膜中，有的可发现滞留菌，但有些菌种未发现滞留菌的存在，提示滞留菌并不是念珠菌生物被膜耐药的唯一机制［33］。

1.6 生物被膜压力应激

生物被膜形成过程中一些压力应激激活可能会引起耐药性。细胞膜压力激活相关信号通路相关蛋白MKC1基因突变会影响菌丝形成、生物被膜形成并且增加其对氟康唑的敏感性［34］。钙调磷酸酶参与调控真菌生理结构，UPPULURI等［35］研究发现钙调磷酸酶增加白念珠菌生物被膜对氟康唑的敏感性。热休克蛋白HSP90可以稳定MKC1蛋白和钙调磷酸酶因而可以维持生物被膜的耐药性，而且，抑制HSP90还可以降低基质葡聚糖合成，抑制HSP90功能可以明显提高生物被膜对各种抗真菌药物的敏感性［36］。

2 抗念珠菌生物被膜的药物或材料

抗念珠菌生物被膜药物主要也是目前临床上使用的抗真菌药物，主要作用于2个靶点：细胞壁或质膜（如棘白菌素类、唑类和多烯类）和核酸或蛋白合成（如氟胞嘧啶）。不过如前所述，念珠菌生物被膜具有较高的耐唑类药物能力，唑类药物在抗生物被膜治疗中不建议使用，见表1。

表1 常用抗真菌药物的抗念珠菌生物被膜活性

2.1 棘白菌素类

真菌细胞壁成分包括几丁质、β-（l，3）-D-葡聚糖和甘露糖蛋白。棘白菌素类抗真菌药物可以抑制β-（1，3）-D-葡聚糖合成酶活性从而抑制葡聚糖的合成，导致细胞壁缺损，最终导致真菌细胞的溶解［43］。目前临床使用的此类药物主要有卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净等。棘白菌素类药物在体外具有较好的抗念珠菌生物被膜活性，卡泊芬净可以抑制细胞黏附于材料表面、改变被膜内细胞的形态和代谢状态，生理血液浓度的米卡芬净体外具有抗念珠菌生物被膜活性［40］。它们还可以通过影响葡聚糖影响胞外多聚基质降低生物被膜的耐药性而发挥作用［19］。中心静脉导管念珠菌病小鼠模型中的研究表明卡泊芬净可以抑制白念珠菌被膜形成［37］，KUCHARIKOVA等［38］使用大鼠支架模型研究也表明所有的棘白菌素类药物都可以有效抑制白念珠菌被膜形成，说明棘白菌素类药物在临床中对念珠菌生物被膜可能会有比较好的疗效。

2.2 多烯类

多烯类药物抗菌机制是通过与细胞膜上的麦角甾醇结合形成通道增加细胞膜的通透性，使胞内一些小分子外泄从而造成细胞死亡。这类药物的代表有两性霉素和制霉菌素。多个体外研究表明高浓度两性霉素B脂质体形式具有较好的抗念珠菌生物被膜活性［39］，不过对近平滑念珠菌生物被膜作用较差［42］。体内实验也表明两性霉素B脂质体可以清除兔体内支架上形成的白念珠菌生物被膜［43］。

2.3 氟胞嘧啶

氟胞嘧啶是作用于核酸合成的抗真菌药物，其作用机制是药物通过细胞的渗透酶系统进入细胞内转化为氟尿嘧啶，竞争尿嘧啶进入真菌的核糖核酸中，从而阻断真菌RNA的合成，最终抑制蛋白质的合成［1］。氟胞嘧啶单独使用容易产生耐药性，所以一般与其他抗真菌药物联用。

2.4 其他潜在的生物被膜治疗药物

2.4.1 抗菌肽 抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的碱性多肽物质，由15～30个氨基酸组成，可以和微生物表面带负电荷的结构分子结合从而抑制微生物生长，抗菌肽还可以通过修饰一些氨基酸基团增强其抗菌效果和稳定性［3］。修饰后的特定靶向性的抗菌肽STAMPs可以有效抑制变异链球菌生物被膜的形成［44］。

2.4.2 一些天然产物 很多中草药活性成分表现出一定的抗生物被膜活性，体外研究表明黄芩素、甘草查尔酮A、苦参碱、黄根醇、麝香草酚、提琴形凹唇姜和灰罗勒中的挥发油、茶树油、桉叶素等都有较好的抗白念珠菌生物被膜的活性，可以抑制生物被膜的形成，有些对成熟的生物被膜也有很强的抑制作用［43］。

2.4.3 协同作用药物 有些药物具有协同作用，可以增强一些临床一线抗真菌药物的抗真菌活性。最新研究表明枸橼酸托瑞米芬可以增强卡泊芬净和两性霉素B体内外抗生物被膜活性［45］，这也为我们提供了生物被膜治疗新思路，也许我们可以通过一些具有协同作用的化合物来增强现有抗真菌药物的抗生物被膜活性。

2.5 具有抗生物被膜活性的生物材料

生物被膜的产生主要是微生物附着于植入的生物器材，因此如何从源头上防治生物被膜的产生也是防治中的重要一环。目前很多研究者致力于研究开发具有一定抗生物被膜形成的生物材料，比如纳米金属颗粒和离子包被、抗菌药物固定嵌入到生物材料中、对生物材料聚合物进行一些特殊修饰等，这些措施都已经在临床上取得了一定的成效［46-47］。

3 问题和展望

念珠菌生物被膜是当前临床感染疾病治疗的一大难题。尽管很多体外研究表明一些化合物具有体外抗真菌或抗生物被膜活性，但只是为药物开发提供了一些研究思路，距离进入临床应用还十分遥远。目前对念珠菌生物被膜感染相关疾病要从防和治两方面着手，在早期以预防为主，包括使用各种具有抗真菌活性的植入器材，尽量避免生物被膜的发生。治疗方面，尽量优先选用针对念珠菌生物被膜有效的抗真菌药物，最大程度发挥药物作用，达到最佳的治疗效果。

致谢

美捷登生物科技有限公司的廖庆娇博士为本文提供了医学编辑的辅助工作，默沙东（中国）投资有限公司为这些辅助工作提供了资助。

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Candida biofilm and antifungal strategies

LI Jianguo. （Intensive Care Unit， Zhongnan Hospital of Wuhan University， Wuhan 430071， China）

R379

A

1009-7708（2016）02-0235-06

10.16718/j.1009-7708.2016.02.020

2015-08-05

2015-10-12

武汉大学中南医院重症监护室； 武汉 430071。

李建国（1952—），男，硕士，主任医师，教授，主要从事重症医学临床和科研工作。

李建国，E-mail：drljg1817@163.com。