脲原体属感染及相关耐药基因研究

张 艳 ， 李苏利， 华 川

脲原体属感染及相关耐药基因研究

张 艳 ， 李苏利， 华 川

目的 探讨脲原体的耐药性及其相关耐药基因分布。方法 采用支原体培养、鉴定和药敏一体化试剂盒对疑似脲原体感染患者的泌尿道分泌物标本进行检测；将筛选得到的脲原体株进行耐药相关基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM PCR扩增并测序分析。结果 ① 117份泌尿道分泌物标本检出54株脲原体。药敏结果显示，脲原体对四环素类药物中的米诺环素敏感率最高（92.6%），耐药率最低（5.6%）；对喹诺酮类药物中氧氟沙星敏感率最低（5.6%），耐药率最高（53.7%）。② 基因测序结果显示：耐药基因tetM在2316、2526二个位点发生突变，分别为G突变为A、T突变为C；parC基因于248位点发生突变，碱基C突变为T，结果导致83位丝氨酸被亮氨酸替换（S83L）；gyrA基因未检测出突变；23SrRNA基因于2149、2181、2230三个位点发生突变，分别为T突变为G、T突变为A、A突变为G。结论 脲原体对四环素类药物敏感率最高，尤其是米诺环素；对喹诺酮类药物耐药最严重，尤其是氧氟沙星，为临床合理用药提供一定依据；parC、23SrRNA、tetM基因相关突变可能与脲原体耐药机制有关。

脲原体； 耐药基因； 基因突变

脲原体是泌尿生殖道感染的重要病原体之一。针对脲原体感染的抗菌药物主要有3大类：四环素类、大环内酯类和喹诺酮类，目前在临床都出现了不同程度的耐药［1-4］。为了解脲原体对常见抗菌药物的耐药率，明确本地区脲原体的耐药机制，现对我院脲原体样本进行核酸提取及gyrA基因、parC基因、23SrRNA基因、tetM基因测序分析。

1　材料与方法

1.1标本来源

收集2013年6月—2014年6月我院检验科细菌室117例患者的泌尿道分泌物标本，标本主要来自妇科、皮肤科及泌尿外科门诊疑似支原体感染患者，其中男15例，女102例，年龄在21～58岁。男性用无菌男性拭子插入尿道2～4 cm处取尿道分泌物；女性用无菌女性拭子在宫颈管内1～2 cm处取宫颈分泌物，取好的标本无菌密封送检。

1.2方法

1.2.1支原体培养、鉴定及药敏试验 采用珠海丽珠试剂有限公司支原体培养、鉴定、药敏一体化试剂盒，对分泌物标本进行支原体培养鉴定及药敏。药敏试验受试药物包括四环素类（多西环素、米诺环素）；大环内酯类（交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素）；喹诺酮类（氧氟沙星、左氧氟沙星、司帕沙星）三类9种抗菌药物。严格按试剂盒说明书进行操作，并将筛选得到的54株脲原体阳性菌液保存于-70 ℃备用。

1.2.2耐药基因扩增及测序分析 从54例脲原体阳性标本中选取仅对上述3大类药物中的一类单独耐药的标本6株（样本号分别为1、21； 19； 3、10、38）及全耐药标本1株（样本号为5）进行耐药基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM扩增并测序分析。

1.2.3脲原体阳性标本核酸的提取 ①取300 μL菌液转至1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心10 min；②小心吸出上清液（尽量吸干上清液，但不要触及沉淀）并弃去，沉淀加700 μL无菌生理盐水混匀，13 000 r/min离心10 min；③重复步骤1次；④向离心管中加入50 µL裂解液，然后用枪头对准沉淀所在位置，将其挑离管底，并反复吹打，用漩涡振荡器振荡将沉淀充分打散；⑤100 ℃温浴10 min，13 000 r/min离心10 min后取上清液待用。

1.2.4引物合成 根据参考文献［5］合成耐药基因gyrA、 parC、23SrRNA、tetM的引物序列，见表1。

1.2.5PCR扩增及测序分析 以提取的脲原体核酸为模板，进行上述耐药基因PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）如下：模板2 μL，引物1.5 μL （20 μmol/L），PCR反应液Mix12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。 gyrA基因、 parC基因、23SrRNA基因的PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。TetM基因PCR程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像。PCR目的基因的纯化产物由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行核苷酸序列测序。耐药株测序结果与GenBank中的相应基因序列进行比较，查找突变位点。

表1　PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in PCR

2.1支原体培养、鉴定及药敏结果

经检测，117份泌尿道分泌物标本检测出54株脲原体，检出率为46.2%。药敏结果显示：脲原体对四环素类药物的敏感率最高，其中米诺环素、多西环素的敏感率分别为92.6%、90.7%；脲原体对喹诺酮类药物中的氧氟沙星耐药率最高，为53.7%，其次为大环内酯类药物中的罗红霉素，为51.8%，见表2。

2　结果

表2　54株脲原体的药敏结果Table 2 Susceptibility of 54 Ureaplasma isolates to antimicrobial agent ［n（ %）］

2.2测序

耐四环类药物的1、21号样本检测出tetM基因，并在2316、2526二个位点发生突变，分别为G突变为A、T突变为C。耐喹诺酮类药物的19号样本检测出parC基因，并于248位点发生突变，碱基C突变为T，结果导致83位丝氨酸被亮氨酸替换（S83L）。gyrA基因未检测出突变。耐大环内酯类药物的3、10、38号样本均检测出23SrRNA基因，于2149、2181二个位点发生突变，分别为T突变为G，T突变为A。10号标本发生上述二位点突变外，于2230位点也发生突变，为A突变为G。5号样本为全耐药标本，检测出2种耐药基因parC基因、23SrRNA基因，其中parC基因于259、324两处发生突变，分别为G突变为A、T突变为C；23SrRNA基因于2149、2181二个位点发生突变，分别为T突变为G、T突变为A。

3　讨论

3.1检出率与耐药情况

本研究117份标本中检出54例脲原体，阳性率为46.2%，远高于宫娜娜等［6］报道的27.3%，但远低于张正国等［7］报道的78.9%，这可能与地域有关，也可能与选取病例的人群构成、检测方法的差异有关。随着抗菌药物的广泛应用，脲原体对抗菌药物的耐药率不断增高，且不同地区报道的耐药率也不尽相同［1-8］。本研究发现脲原体对四环素类药物较其他2类药物的敏感性强，且对米诺环素的敏感率最高，为92.6%；而对喹诺酮类药物中的氧氟沙星耐药率最高，为53.7%。从而提示本地区临床用药时应参照药敏结果慎重选择。

3.2耐药相关基因分析

3.2.1四环素类药物与tetM基因 四环素类药物的抗菌作用方式是通过与核糖体30S亚基的A位点结合抑制氨基酰tRNA与核糖体的结合，从而阻断蛋白合成［9］。脲原体对四环素耐药机制与其携带tetM基因有关。tetM基因是5类（M、O、P、Q、S）核糖体保护基因中的一类，它可编码一种保护蛋白，对四环素耐药的微生物大多可以产生这此种蛋白，该蛋白能与核糖体结合使微生物免受四环素类药物的作用影响，从而产生耐药。本研究中，耐四环类药物的1、21号样本均检测出tetM基因，并在2316、2526二个位点发生突变，分别为G突变为A、T突变为C。但是不是所有耐四环素类药物的脲原体都能检测出terM基因？敏感菌株会不会也携带tetM基因？之后的学者们就这2个问题进行了深入研究。程文海等［10］研究耐四环素类药物的脲原体发现2株检测tetM基因为阴性，这就提示我们对于四环素类药物，除tetM基因以外，脲原体还可能有新的耐药机制。有学者在敏感菌株中也发现了terM基因的存在，但tetM基因与药敏状态有关联［11］，提示该基因可能要与其他机制共同作用才能产生耐药。

3.2.2大环内酯类药物与23SrRNA基因 目前临床常用于治疗泌尿生殖道感染的大环内酯类药物有克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素等，关于脲原体对大环内酯类药物耐药性，各地区文献报道结果不一。我们研究发现，我院分离的脲原体对罗红霉素的耐药率高达51.8%。目前与耐大环内酯类药物机制相关的概念有：红霉素甲基化酶基因、外排泵MF基因表达［12-13］、23SrRNA基因的突变。孟冬娅等［14］推测脲原体对大环内酯类药物的耐药机制与其核糖体23SrRNA碱基突变或甲基化有关。也有文献报道了与脲原体致病性相似的人型支原体23SrRNA中的突变是其对大环内酯类药物耐药的主要机制［15-16］；本研究选取3株耐大环内酯类的脲原体菌株，进行23SrRNA基因扩增并测序分析，结果发现有三个位点突变：2149、2181、2230，分别为T突变为G、T突变为A、A突变为G。不同的大环内酯类药物在支原体23SrRNA内有不同的结合位点，突变位点的存在可能是导致不同耐药表型产生的分子基础。

3.2.3喹诺酮类药物与gyrA和gyrB基因 本文药敏结果显示脲原体对喹诺酮类药物中的氧氟沙星耐药率最高（53.7%）。喹诺酮类药物的作用靶位为细菌的Ⅱ型拓扑异构酶，包括旋转酶和拓扑异构酶Ⅳ。旋转酶是由gyrA和gyrB组成的A2B2四聚体，分别由gyrA和gyrB基因编码。拓扑异构酶Ⅳ是parC和parE组成的C2E2四聚体，分别由parC和parE基因编码［17-18］。赵缜等［19］研究发现脲原体对喹诺酮类药物的耐药机制主要是菌株DNA螺旋酶和拓扑异构酶Ⅳ序列发生碱基突变，导致喹喏酮类药物不能与酶蛋白-DNA复合体结合，从而产生耐药。MAZAARIOL等［20］报道gyrA、gyrB、ParC、ParE等区域的基因突变会导致大肠埃希菌对喹诺酮类的耐药，这些区域称为喹诺酮耐药决定区域（QRDA）。本研究发现，耐喹诺酮类药物的脲原体第19号样本检测出parC基因变异，该基因于248位点发生突变，碱基C突变为T，结果导致83位丝氨酸被亮氨酸替换（S83L）。最近KAWAI等［21］研究的158例日本人群样本中发现37株parC S83L突变，突变率达23.4%，他们还发现1株ParC S83L-GyrB P462S双突变。BEETON等［22］研究发现除S83L突变外，还存在D112E突变和ParC蛋白125位或136位氨基酸突变。这提示脲原体对喹诺酮类耐药基因gyrA和parC的突变类型可能存在地域性差异。因此有必要针对性地检测本地区脲原体耐药基因的突变特点，对于明确本地区的耐药机制有着重要意义。

综上所述，我们对本地区脲原体对四环素类、大环内酯类、喹诺酮类药物耐药情况及耐药机制进行了研究，发现脲原体对四环素类药物敏感率最高，对喹诺酮类药物耐药最严重，且parC、23SrRNA、tetM基因相关突变可能与本地区脲原体耐药机制有关。一方面提示临床医师治疗此类感染时应参考药敏结果合理选用抗菌药物。另一方面也提醒我们要加强对脲原体的耐药监测并及时与临床沟通，以减少耐药菌株的产生。

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Study on resistance genes in Ureaplasma isolates

ZHANG Yan， LI Suli， HUA Chuan. （Laboratory Department， the NO.252 Hospital of PLA， Baoding Hebei 071000， China）

Objective To examine the relationship between resistance genes and antibiotic resistance in Ureaplasma isolates. Methods Mycoplasma assay kits were used to culture and identify Ureaplasma isolates and perform antimicrobial susceptibility testing. PCR and DNA sequencing analysis were conducted to analyze relevant genes， including gyrA， parC， 23SrRNA， tetM. Results The results of susceptibility testing showed that more than 92.6% of Ureaplasma isolates were susceptible to minocycline and doxycycline. More than half （53.7%） of Ureaplasma isolates were resistant ofloxacin. One isolate was resistant to all the drugs tested. Sequencing analysis of resistance genes revealed two mutations in tetM gene， one mutation in parC gene， and three mutations in 23SrRNA gene， but no mutation in gyrA. Conclusions Ureaplasma isolates were relatively sensitive to tetracyclines， but more resistant to quinolones. The resistant genes like parC， 23SrRNA and tetM play an important role in development of resistance in Ureaplasma.

Ureaplasma； resistant gene； gene mutation

·论著·

R375

A

1009-7708（2016）01-0067-05

10.16718/j.1009-7708.2016.01.015

解放军252医院检验科，河北保定 071000。

张艳（1982—），女，硕士研究生，主要从事临床检验工作。

张艳，E-mail： breeze0827@sina.com。

2015-03-16

2015-05-18