氟哌啶醇抑制cuprizone诱导脱髓鞘小鼠鞘损修复

吴锡艳 陈 东 汪 云 李成仁 王晗知肖 岚

（第三军医大学基础部组织胚胎学教研室，重庆 400038）



论 著

氟哌啶醇抑制cuprizone诱导脱髓鞘小鼠鞘损修复

吴锡艳 陈 东 汪 云 李成仁 王晗知*肖 岚

（第三军医大学基础部组织胚胎学教研室，重庆 400038）

目的 观察非典型性抗精神病药氟哌啶醇对cuprizone诱导脱髓鞘小鼠髓鞘修复的影响，探讨脑白质损伤在精神分裂症病理机制中的作用。方法 利用cuprizone喂食C57Bl/6小鼠建立脱髓鞘小鼠模型，采用快蓝染色、免疫组织化学等方法检测各组髓鞘变化，观察氟哌啶醇对髓鞘修复的作用。结果 成功建立cuprizone诱导的脱髓鞘小鼠模型，0.2%cuprizone摄入6周胼胝体脱髓鞘损伤达到最大；停药后髓鞘自发性修复，3周后几乎恢复正常水平；在髓鞘修复同时给予氟哌啶醇，可以推迟髓鞘的自发性修复。结论 氟哌啶醇抑制髓鞘的修复再生，这可能是氟哌啶醇加重精神分裂症患者阴性症状的原因之一。

少突胶质细胞；脱髓鞘；髓鞘修复；氟哌啶醇；精神分裂症

精神分裂症是一组病因未明的重性精神疾病，全球发病率为0.4%～1%［1］，是最常见的精神疾病。由于精神分裂症的病因未明，目前对精神分裂症的一线治疗主要依靠使用抗精神病药物。典型性抗精神病药，如氟哌啶醇（haloperidol，HAL），其药理机制主要通过抑制多巴胺D2类受体发挥作用，能有效改善精神分裂症的阳性症状，如幻觉、妄想、思维及语言的混乱等，但往往加重如情感淡漠、语言匮乏、快感缺乏等阴性症状以及认知障碍［2］，导致患者停药而引起病情的反复。

在对精神分裂症的发病机制研究中，发现精神分裂症的阴性症状/认知障碍可能与白质异常密切有关［3］。大脑白质主要由少突胶质细胞产生髓鞘膜包裹轴突形成，少突胶质细胞可能参与精神分裂症病理机制。慢性给予HAL或奥氮平的恒河猴中，均可观察到星形胶质细胞以及少突胶质细胞数目的减少［4］；而我们之前的研究也发现，HAL可以促进胼胝体区NG2+细胞活化增殖，即对少突胶质细胞前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的增生有促进作用［5-7］，提示HAL对髓鞘损伤修复的作用可能与其药效密切相关。

本实验旨在利用cuprizone诱导的特异性脱髓鞘模型，了解典型性抗精神病药HAL对髓鞘修复的影响，并应用Luxol快蓝-过碘酸-希夫染色（LFB-PAS）组织化学、髓鞘碱性蛋白MBP免疫组织化学等不同方法检测髓鞘修复情况，以期明确抗精神病药对脑白质损伤修复的影响，为少突胶质细胞的退变可能参与精神分裂症病理生理过程的阐明提供神经药理学实验依据。

材料和方法

1 实验动物及主要试剂

1.1 动物

6～8周龄C57Bl/6雄性小鼠，由第三军医大学实验动物中心提供。所有动物饲育于恒温环境，12h明暗昼夜循环。饲料如常喂养，每周称量体重。

1.2 试剂

山羊抗MBP多克隆抗体，1：200（Santa Cruz）；驴抗山羊IgG-HRP，1：200（DAKO）；DAB试剂盒（Boster，China）显色。

2 动物分组及模型制备

2.1 Cuprizone脱髓鞘模型建立

实验分组：含0.2%cuprizone（w/w）饲料饲育6周，分别于6周和9周取材，每组动物6只；每个平行时间点取正常饲料饲育动物，每组动物6只（图1A）。

2.2 氟哌啶醇对cuprizone脱髓鞘后修复的影响

药物投放于饮水中以代替动物每日饮水。与多次注射相比，饮水能有效降低动物的应激反应以及神经肌肉损害。

对照组（CTL）：正常饲料及饮水饲育8周；cuprizone+溶媒组（CPZ+Veh）：含cuprizone饲育6周后恢复正常饲料及饮水2周；cuprizone+氟哌啶醇组（CPZ+HAL）：cuprizone饲育6周后，恢复正常饲料，同时饮水中加入氟哌啶醇（2mg/kg/day），饲育2周；每组动物6只。

3 实验方法

3.1 组织准备

腹腔注射戊巴比妥钠（10mg/kg体重）后，从左心室灌注生理盐水冲洗血管，随后用4%多聚甲醛（PFA）固定，至全身僵硬，小心剥取脑组织，4%PFA后固定，4℃过夜；30%蔗糖脱水，4℃过夜。标本用OCT包埋后冰冻切片机连续冠状切片，片厚25μm，切片范围从前囟点 -1.70mm至-2.46mm（根据Paxinos&Franklin著小鼠大脑图谱）。切片放于冰冻保护液中于4oC保存。

3.2 LFB-PAS染色

将大脑切片裱在铬钒明胶包被的载玻片上，置于60℃烤箱烤片2h。浸入1：1酒精/氯仿溶液中脱脂24 h，95%酒精脱水；置于Luxol快蓝染液中染色56℃8 h（不超过16 h）；95%酒精洗涤多余染色，双蒸水漂洗，碳酸锂溶液分色30s，70%酒精继续分色30s；反复双蒸水漂洗，显微镜下观察正常对照切片，直至灰质部分与白质清晰区分。分色完全后，切片置于双蒸水中。置于Schiff试剂15min，切片变成浅粉红色，自来水清洗5min，切片变为暗粉红色；苏木精复染1min，自来水冲洗5min。95%酒精至100%酒精脱水，2次，每次5min，二甲苯透明，中性树脂封片。

3.3 免疫组织化学染色

冰冻切片置于0.3%过氧化氢-甲醇中封闭15min。0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，每次5min。0.3%Triton X-100及0.5% 牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1h。滴加0.2%BSA/0.01mol/ L PBS稀释的第一抗体，置于湿盒内孵育4℃过夜。HRP酶标记第二抗体2h。漂洗后DAB试剂盒（Boster，China）显色，显微镜下观察，适时终止反应，终产物为棕褐色沉淀。Olympus BX51显微镜观察、记录。

免疫反应结果通过计算机软件Image Pro Plus进行定量分析。

4 统计学方法

数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计学软件进行t检验分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

正常对照组大脑冠状切片经LFB-PAS染色后，灰质复染为红色，白质呈蓝色，境界清晰，胼胝体染成深蓝色，与周围结构区分明显（图1B）。对白质束集中的胼胝体区的观察发现，第6周时，整个胼胝体蓝染的区域几乎消失殆尽，表明胝体区域脱髓鞘作用达到最大；而第9周即停药3周后，髓鞘自发性恢复接近正常水平；大脑胼胝体MBP染色的光密度值变化与LFB结果趋势相同（图1 B）。由此表明cuprizone诱导的脱髓鞘模型成功建立。

停药后，cuprizone对髓鞘的损伤作用消失，髓鞘以自我修复为主，快蓝染色可见CPZ+Veh组胼胝体区有蓝染，说明髓鞘开始修复。但CPZ+HAL组与CPZ+Veh组相比，蓝染较浅（图2 A）；比较胼胝体MBP免疫组织化学染色的平均光密度值，CPZ+ HAL组的MBP染色强度明显低于CPZ+Veh组，提示HAL可能影响髓鞘自发性修复（图2 B）。

图1　Cuprizone诱导脱髓鞘小鼠模型制备。A，实验分组示意图，箭头所示为取材时间点；B，cuprizone诱导的脱髓鞘及髓鞘修复模型中Luxol快蓝染色及MBP免疫组织化学染色，图片所示均为胼胝体区；标尺，100μmFig.1 Establishment of cuprizone-induced demyelin mouse model.A，schematic diagram displaying the experimental protocol；arrows showing sacrifiedtime point.B，Luxol fast blue and MBP immunostaining for cuprizone-induced demyelin and remyelin models in corpus callosum area；Scale bar，100μm

图2　Hal对脱髓鞘小鼠髓鞘修复的影响。A，各组Luxol快蓝染色及MBP免疫组织化学染色，图片所示均为胼胝体区；B，MBP免疫反应性统计学分析；标尺，200μm；*，与 CTL比较，0.01＜P＜0.05；△，与 CPZ+Veh比较，0.01＜P＜0.05Fig.2 Effect of haloperidol on remyelination in cuprizone-induced demyelin mouse.A，Luxol fast blue and MBP immunostaining for mediolateral area of the corpus callosum of the mice.B，statistic analysis of MBP immunoreactivity in the corpus callosum of indicated groups；scale bar，200μm；*，0.01＜P＜0.05，compared with CTL group；△，0.01＜P＜0.05，compared with CPZ+Veh group

讨 论

精神分裂症是最常见的精神疾病，然而其病因至今不明。本研究通过观察典型性抗精神病药物HAL对髓鞘修复的影响，进一步证明其对阴性症状/认知障碍的副作用可能与其对白质的影响有关。

C57BL/6小鼠在摄食中掺入cuprizone是经典的脱髓鞘模型，可以诱导多个大脑脑区高度可修复的脱髓鞘病变［8］。在5～6周的cuprizone处理之后，小鼠胼胝体区脱髓鞘作用达到最大化，这个过程称之为“急性脱髓鞘”。接下来几周小鼠恢复正常饲料，将会出现自发性的完全性的髓鞘修复。相反，cuprizone处理时间延长（12周或者更久），髓鞘修复能力则明显受限，这一过程称为“慢性脱髓鞘”。通过掌控给予cuprizone的时间，能够使动物在急性脱髓鞘后髓鞘重新恢复，因此这种模型尤其适合于髓鞘脱失及再生机制的研究，同时该模型还具有价格低廉，易于维持等优点。目前文献证实，髓鞘损伤的动物可以表现类似人类精神分裂症的行为学表型［9］。摄入含cuprizone的大鼠在注意力转移实验（前额叶皮层行为学量表）中表现出特定的认知障碍［10］。前额叶皮层是被认为完成高级认知任务的主要部分，它执行着如计划和问题解决等高级的认知和功能。前额叶皮层行为学量表也被公认为威斯康辛卡片分类测验（WCST）的动物学模型，而已知精神分裂症患者往往能通过WCST发现异常。由于胼胝体向来被看作脑白质损伤的指示剂，在本研究中，我们通过LFB组织学染色和MBP免疫组织化学染色两种方法确认胼胝体髓鞘脱失变化，两种方法结果同步显示了实验动物的脱髓鞘以及自发性髓鞘再生的改变，在连续给予cuprizone 6周后，动物胼胝体区髓鞘脱失明显，恢复正常饲料3周后髓鞘几乎恢复如常，与之前文献报道相符［8］，表明cuprizone诱导的小鼠脱髓鞘模型成功建立。

HAL是典型性抗精神病药，对精神分裂症阳性症状的改善效果显著，但是却无法改善甚至反而加重阴性症状［11］。目前，已有文献证实，精神分裂症阴性症状与白质异常改变明显相关［12，13］，而精神分裂症阴性症状/认知障碍往往与白质病理改变密切关联。本研究结果从另一个方面证明了HAL对白质损伤的作用可能在于通过阻止髓鞘修复再生能力。这一结果为HAL与精神分裂症阴性症状之间的关系提供了进一步的证据，意味着少突胶质细胞在精神分裂症发病机制中发挥作用，而HAL可能是通过改变少突胶质细胞功能而影响精神分裂症阴性症状。HAL作为抗精神病药，广泛用于拮抗纹状体的多巴胺D2受体家族，减轻大脑边缘叶和黑质通路的多巴胺能神经递质作用。但是，在中枢神经系统多巴胺受体同样表达于非神经细胞。不成熟的少突胶质细胞前体细胞表达D3受体，而成熟的少突胶质细胞特异表达D2受体［14］，D2/D3受体均属于D2受体家族［15］，这意味着多巴胺可能与少突胶质细胞发育有关。D3R激动剂Quipirole可以促进OPCs细胞分化成为较为成熟的A2B5+细胞［14］，而HAL可能通过阻断D3R从而抑制了少突胶质细胞前体细胞的分化形成髓鞘的能力［16］。因此，HAL对髓鞘修复的抑制效应也许通过D3R途径完成。我们前期实验发现典型性抗精神病药HAL可活化正常成年小鼠脑内OPCs［5，6］。同时我们还发现，另一类非典型性抗精神病药喹硫平（quetiapine，QUE）可以促进OPCs发育和分化，并且预先QUE处理的脱髓鞘模型小鼠可以明显减少髓鞘损伤［17，18］。因此可以认为非典型性抗精神病药QUE对脱髓鞘损伤有预防作用，而QUE被认为对精神分裂症认知障碍有非常显著的治疗疗效［19］。以上研究提示抗精神病药在脱髓鞘修复中扮演了一定的角色，这可能是其发挥抗精神病作用的药理学机制之一，并且不同种类抗精神病药物，通过作用的不同受体，对少突胶质细胞/髓鞘效果不尽相同。

由此可见，白质的改变可能是抗精神病药的作用靶点之一，而HAL对髓鞘再生的抑制作用，可能是HAL加重精神分裂症患者阴性症状/认知障碍的原因。本研究同时也为少突胶质细胞的退变可能参与了精神分裂症病理生理过程的阐明提供了神经药理学实验依据。

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Haloperidol inhibits the remyelination of cuprizone-induced demyelination in mice

Wu Xiyan，Chen Dong，Wang Yun，Li Chengren，Wang Hanzhi*，Xiao Lan
（Department of Histology and Embryology，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

Objective To clarify the role of white matter dysfunction in the pathophysiology of schizophrenia through examination of the effect of the antipsychotic haloperidol on remeyeliantion in the mouse model of cuprizone-induced demyelination.Methods The C57Bl/6 mouse model of demyelination was established by using a diet supplemented with 0.2%cuprizone.Luxol fast blue staining and MBP immunostaining were used to detect demyelination and remyelination in the model mice treated with or without haloperidol.Results The loss of myelin was more pronounced in mice fed with 0.2%cuprizone for 6 weeks.Spontaneous remyelination was observed in the subsequent 3 weeks after cuprizone withdrawal，while haloperidol delayed the progress of the spontaneous remyelination. Conclusion Haloperidol inhibits the remyelination of the white matter lesion，which may be one of the mechanisms underlying the effect of haloperidol exacerbating negative symptoms of schizophrenia.

oligodendrocyte；remyelination；haloperidol；schizophrenia

R749.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-18 〔修回日期〕2016-03-31

国家自然基金（青年基金）资助项目（31000482）

吴锡艳，女（1979年），汉族，硕士

（To whom correspondence should be addressed）：wang.hanzhi@foxmail.com