丹参含药血清抑制瘦素及Hh信号通路激活诱导的大鼠肝星状细胞中EVC2和Gli2表达上调

韩仕庆曹文富*冯藜　枥

（重庆医科大学1中医药学院，2中医药研究室，3附属第一医院中西医结合科，重庆 400016）



丹参含药血清抑制瘦素及Hh信号通路激活诱导的大鼠肝星状细胞中EVC2和Gli2表达上调

韩仕庆1，2曹文富1，2*冯藜枥3

（重庆医科大学1中医药学院，2中医药研究室，3附属第一医院中西医结合科，重庆 400016）

目的 观察丹参含药血清是否可以通过抑制瘦素诱导的刺猬（Hedgehog，Hh）信号通路中纤毛蛋白（Ellis-van creveld syndrome protein 2，EVC2）和锌指转录因子2（GLI family zinc finger protein 2，Gli2）的表达从而抑制大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的增殖。方法 丹参水煎剂、生理盐水灌胃大鼠10天后收集各组血清。应用高效液相色谱仪检测丹参含药血清中有效成分（丹参素、丹参酮IIA）的含量。将处于对数生长期的HSCs传代于6孔板，分为6组（空白对照组、瘦素组、瘦素+抑制剂组、瘦素+丹参组、瘦素+激动剂组、瘦素+激动剂+丹参组），每组分别培养在相应含药血清中，24h后收集细胞。采用MTT检测细胞增殖情况，免疫荧光检测EVC2在各组HSCs中的表达，Western blot测定EVC2和Gli2蛋白水平，RT-PCR法检测EVC2和Gli2 mRNA水平。结果 瘦素能刺激HSCs的活化增殖，使EVC2和Gli2表达量显著升高；Hh通路抑制剂和丹参能抑制瘦素对HSCs增殖的活化作用和对EVC2、Gli2表达的上调作用；丹参对Hh通路激动剂与瘦素共同作用所致的HSCs增殖极强活化和EVC2、Gli2表达极强上调也具有明显抑制作用。结论 丹参可以通过抑制Hh信号通路中EVC2、Gli2的表达，从而对活化的HSCs产生抑制作用。

Hh信号通路；肝星状细胞；EVC2；Gli2；肝纤维化

肝纤维化是肝脏对各种原因引起的肝组织损伤的一种慢性持续性修复反应，其形成是细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）合成大于降解的病理过程。肝内ECM的合成主要来源于活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSCs）。近年实验表明，刺猬（Hedgehog，Hh）信号通路的异常激活可使HSCs活化增强从而促进肝纤维化。在胚胎发育期间，Hh信号通路是调控祖细胞的生长和分化及各组织、器官生长的一条相对保守的信号转导通路。在肝脏受到损伤后，这条信号通路被激活，活化的Hh信号通路参与肝损伤修复反应的多个方面，包括肝祖细胞的增殖，肌成纤维细胞的转化与生成，肝脏多种细胞的凋亡等［1］。目前认为，Hh信号通路由Hh配体、膜蛋白受体复合物、核转录因子和下游靶基因4部分组成［2］。纤毛蛋白（Ellis-van creveld syndrome protein 2，EVC2）在Hh信号传导中作为正向调节因子在膜蛋白受体复合物（主要为7次跨膜蛋白Smo）下游传递信号因子并激活锌指因子相关蛋白［3］，使锌指因子蛋白复合物（如：Gli2/3A）从抑制复合物上解离下来。当Gli2/3A蛋白复合物从微管上解离后，经酶磷酸化使锌指转录因子2（GLI family zinc finger protein 2，Gli2）得到释放［4］。随后Gli2在核中聚集，转为较强的转录活性形式（Gli2-A），激活下游靶基因并促进HSCs的不断活化增殖，由此可能促进肝纤维化发展。缺失Evc2不影响Smo被激活，但能抑制Smo激活下游Hh信号，由此说明Evc2是激活Gli成为活性状态的关键因子。Gli2的表达可直接反映Hh信号通路的活性状态，是Hh信号通路的主要转录激活子［5］。激活的Hh信号通路促使HSCs不断活化与增殖，分泌大量ECM，使得ECM不断沉积，加重肝纤维化。有实验表明［6］，瘦素可通过上调Hh信号通路中Gli的表达激活Hh信号通路；瘦素激活Hh信号通路后Gli2是参与HSCs增殖和肝纤维化发展的重要因子［7］；瘦素可通过多途径（如：JAK，P38，ERK/12信号通路）诱导HSCs不断活化增殖［8-11］。活化的HSCs自表达Hh配体，激活Hh信号通路，使HSCs增殖形成恶性循环，形成肝纤维化［12］。本研究应用瘦素诱导HSCs不断活化增殖，建立肝纤维化模型，选择Hh信号通路中起关键作用的Evc2和Gli2作为观察对象，采用丹参和抑制剂（cyclopamine）干预被活化的HSCs，观察上述药物对EVC2和Gli2是否产生抑制作用，并且比较丹参与抑制剂的抑制程度；同时，以Hh信号通路特异性激动剂（purmorphamine）充分活化Hh信号通路，使HSCs不断增殖，模拟重度肝纤维化，并在此基础上观察丹参是否仍具有干预作用。

材料和方法

1 材料

180g～200g SD大鼠40只（雌雄各半），购自重庆医科大学实验动物中心。HSCs购自重庆医科大学附属第二医院消化科，丹参购自重庆医科大学附属第一医院中药房。Hh通路激动剂（purmorphamine）和抑制剂（cyclopamine）购自Selleck公司，兔抗鼠EVC2抗体购自Santa Cruz，兔抗鼠Gli2购自北京博奥森公司，羊抗兔HRP二抗购自北京中杉公司，羊抗兔FITC荧光二抗购自北京冠星宇科技有限公司，四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司，瘦素购自PeproTech。岛津高效液相色谱仪（岛津LC-20A），PCR仪（Applied Biosy Stems），核酸蛋白分析仪（BECKMAN DU640），凝胶成像系统（Blo-RAO Gel Doc 2000），激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP2，德国）。

2 含药血清制备

体重140～160g清洁级大鼠40只（雌雄各半），随机平均分为丹参水煎剂、生理盐水2组，动物房正常饲养1周，至体重在180～200g时，分别以丹参水煎剂、生理盐水灌胃，每日8：00 am定时灌胃一次，连续给药10d。丹参水煎剂组以高剂量6.25g/kg/d灌胃（丹参灌胃低剂量为1.5625g/kg，依据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”所得，2倍、4倍剂量作为中、高剂量）。空白组给予生理盐水10ml/kg/d。末次给药后1h，每只大鼠用不加抗凝剂无菌取血管心脏采血5～7 ml，4℃静置过夜后，1000 r/min离心5min，取上清液即为含药血清，经56℃水浴灭活，0.22μm微孔过滤器过滤除菌后分装于1.5 ml冻存管，标记后置于-80℃冰箱备用。

3 高效液相色谱法检测丹参含药血清中丹参有效成分

将丹参高剂量血清稀释2倍和4倍，得到丹参低、中、高剂量血清。为了解大鼠进行丹参溶液灌胃后所得血清中丹参有效成分（如丹参素、丹参酮IIA）的吸收情况及合理的干预细胞丹参含药血清浓度，用高效液相色谱法测定大鼠丹参含药血清中丹参素和丹参酮IIA的含量。首先考察了以下流动相对给药后血浆样品测定的影响，流动相A：乙腈-0.1%甲酸水；流动相B：乙腈-1%醋酸水。结果表明，只有流动相B使丹参素、丹参酮IIA和内标达到了基线分离，且极性较小的酚酸类成分基本不干扰样品中丹参素和丹参酮IIA的测定。色谱条件为4.6mm× 250mm（Hypersil ODS25μm，型号：E2117074，批号：10643大连伊利特）；以乙腈-1%醋酸水为流动相，进行梯度洗脱；检测波长为270nm，流速1.0 ml/min，进样20μl，柱温为室温。丹参素线性关系考察y=2053.4x+789.94（R2=1），线性范围为0.020813-0.666μg/ml。丹参酮IIA的线性关系考察y= 77647x+1046.6（R2=0.9995）。线性范围为0.003125-0.1μg/ml。所得丹参含药血清中仍然含有丹参素和丹参酮IIA等有效成分，且丹参高剂量含药血清中丹参有效成分丹参素和丹参酮的含量显著高于丹参中、低剂量血清。所以实验选择丹参高剂量含药血清干预HSCs。

4 细胞培养

将HSCs置于含10%胎牛血清培养基中，37℃，5%CO2孵箱中培养，每天8：00 am换液，当处于对数生长期时，加入0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代。将处于对数生长期的HSCs细胞以5×105/ml密度接种于6孔板，分成空白对照组、瘦素组、瘦素+抑制剂组、瘦素+丹参组、瘦素+激动剂组、瘦素+激动剂+丹参组共6组进行分组处理。除空白对照组外，其余各组均加入100μg/L瘦素。其中空白对照组以10%空白鼠血清培养，瘦素组以10%空白鼠血清+瘦素培养，瘦素+抑制剂组以10%空白鼠血清+瘦素+抑制剂（20μmol/L）培养，瘦素+丹参组以10%丹参鼠血清+瘦素培养，瘦素+激动剂组以10% 空白鼠血清+瘦素+激动剂（1μmol/L）培养，瘦素+激动剂+丹参组以10%丹参鼠血清培养+瘦素+激动剂（1μmol/L）。

5 MTT检测各种含药血清对HSCs增殖的影响

取对数生长期细胞，常温下1000r/min离心5min，弃上清液，加入10ml培养基混匀制成细胞悬液，倒置显微镜下用血细胞计数板计数。将细胞悬液按1×105/ml接种于96孔板中，每孔100μl，分为上述6个组，每组5个复孔，于37℃、5%CO2孵箱中培养。培养24h后弃孔内培养液，按实验分组加入相应含药血清，培养1h后加入瘦素。培养24h后每孔加入 MTT溶液（5g/L）20μl，37℃孵育4h后终止培养，弃上清后每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡10min，使结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪取490nm波长下，测定各孔吸光度，检测细胞活力。

6 EVC2免疫荧光检测

将生长于玻片上的细胞用0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.4）浸洗3次，每次3min。各组细胞用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，pH7.4）固定15min，PBS浸洗3次（每次3min）后，用0.5%Triton X-100室温通透20min；PBS浸洗3次（每次3min）后用正常山羊血清室温封闭30min；吸水纸吸掉封闭液，滴加兔抗EVC2抗体（1：1000），4℃孵育过夜；PBS浸洗玻片3次（每次3min）后，滴加FITC标记的羊抗兔IgG（1：200），湿盒中37℃孵育1h，PBS浸洗玻片3次（每次3min）后，复染核、封片；激光共聚焦显微镜下观察拍照。

7 EVC2和Gli2 Western blot检测

收集细胞加入含蛋白酶抑制剂的蛋白提取液提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。根据蛋白浓度计算上样量。蛋白定量：定量称取10mg标准蛋白，加蒸馏水，溶解定溶到100ml。取6支试管，编号为0-5，分别加入标准蛋白溶液0、20、40、60、80、100ul；用蒸馏水补充体积至100ul。各试管加入工作液2ml；混匀，37℃水浴30min。以分光光度计上0为参比；检测各样品562nm的吸光度值。蛋白浓度为横座标、吸光度为纵座标绘制标准曲线，取100ul样品溶液；按步骤1-4检测；将吸光度值填入标准曲线；计算蛋白浓度。配制10%的分离胶和5%浓缩胶，蛋白样品加入SDS上样缓冲液，100℃变性5min，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜（PIERCE膜），5%牛奶封闭2h，一抗（1：1000）孵育4h，PBS洗15min×3次。加HRP标记羊抗兔IgG（1：1000，用PBS配制），室温下1～2h，4℃过夜，PBS洗15min×3次。显影：将膜置于发光盘中，发光1～2min；将膜取出，放于曝光夹中，曝光夹中应预先铺有一层薄膜，将薄膜对折压于膜上（膜的正面向上），在黑暗中取出胶片，铺于膜上，将曝光夹关上，曝光2～3min。将胶片从暴光夹中取出，放入显影液中显影。将胶片从显影液中取出，放入水中快速洗一下，然后定影，并扫入凝胶成象系统进行图象分析（Blo-RAO Gel Doc 2000），计算光密度值（OD值=目的蛋白光密度值/内参蛋白光密度值）。重复3次。

8 EVC2和Gli2 mRNA RT-PCR检测

细胞培养达到对数生长期时，收集细胞于1.5ml EP管中进行RNA提取，紫外分光光度计测定RNA浓度，逆转录后进行PCR反应，加样完全后，充分混匀，简短离心。根据GenBank上所查mRNA序列，采用软件设计引物，以GAPDH作为内参对照，EVC2、Gli2和GAPDH引物序列见表2。PCR仪反应条件：94℃，5min→（94℃，30s→57℃，30s→72℃，30s）×30 cycles→72℃，10min。PCR产物经浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统进行扫描拍照，灰度值用Image J软件进行分析。

表1　EVC2、Gli2与内参基因引物序列及产物大小

9 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件分析，组间比较为单因素方差分析，P＜0.01有显著统计学意义，P＜0.05有统计学意义，应用Prism 5软件作图。

结 果

1 丹参抑制瘦素与Hh通路激活诱导的HSCs活化增殖

瘦素与各种药物干预体外培养的大鼠HSCs 24h后，应用MTT法检测HSCs的活化增殖。结果显示，瘦素处理后，HSCs活力明显增加；在瘦素处理的同时，加入Hh通路抑制剂和丹参均可抑制瘦素对HSCs活力的增强作用。在瘦素和Hh通路激动剂共同作用下，HSCs的活力较单纯瘦素作用后活力的增加更为明显，丹参对这种增加作用也具有极强的抑制作用（图1）。由此表明，丹参对瘦素对Hh通路激活诱导的HSCs活化增殖具有明显的抑制作用。

图1　MTT法检测丹参含药血清对瘦素及Hh通路激活增强HSCs活力的影响。a，与空白对照组比较，P＜0.01；b，与瘦素组比较，P＜0.01；c，与瘦素+激动剂组比较，P＜0.01Fig.1 MTT detection for the effect of Danshen-containing serum on the viability elevation of HSCs by leptin and Hh pathway activation.a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01；compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group

2 丹参抑制瘦素与Hh通路激活所致的HSCs中EVC2和Gli2表达上调

图2　丹参抑制瘦素与Hh通路激活所致的HSCs中EVC2上调的免疫荧光检测。A，空白对照组；B，瘦素组；C，瘦素+抑制剂组；D，瘦素+丹参组；E，瘦素+激动剂组；F，瘦素+激动剂+丹参组；G，各组EVC2荧光强度的统计分析；比例尺，40μm；a，与空白对照组比较，P＜0.01；b，与瘦素组比较，P＜0.01；c，瘦素+激动剂组相比，P＜0.01；d，与瘦素+抑制剂组比较，P＞0.05Fig.2 Immunofluorescence detection for inhibition of Danshen-containing serum on the upregulation of EVC2 induced by leptin and Hh pathway activation in HSCs.A，Blank control group；B，Leptin group；C，Leptin plus inhibitor group；D，leptin plus Danshen group；E，Leptin plus agonist group；F，group leptin plus agonist and Danshen；G，Stastistic anlysis of EVC2 fluovescence intensity in the indicated groups；a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，compared with leptin plus agonist group，P＜0.01；d，P＞0.05，compared with leptin plus inhibitor group

免疫荧光染色显示，瘦素可使HSCs内EVC2免疫反应性明显增强（图2B），Hh通路抑制剂和丹参均可明显抑制瘦素对HSCs内EVC2免疫反应性的增强作用（图2C、2D）；在瘦素和Hh通路激动剂共同处理的HSCs中，EVC2免疫反应性增强最为明显（图2E），丹参可显著抑制这种增强作用（图2F）。

Western blot检测显示，瘦素可明显上调HSCs内EVC2和Gli2蛋白水平，Hh通路抑制剂丹参均可明显抑制瘦素对HSCs内EVC2和Gli2蛋白水平的上调作用；用瘦素处理的HSCs同时给予Hh通路激动剂处理，EVC2和Gli2蛋白水平的上调作用更加明显，但可被丹参明显抑制（图3）。

图3　丹参含药血清下调Hh信号通路中Gli2蛋白和EVC2蛋白在HSCs中的表达。A，丹参含药血清下调Hh通路中EVC2蛋白和Gli2蛋白在HSCs中表达的Western blot检测；B，丹参含药血清下调Hh通路中EVC2蛋白在HSCs中统计学分析；C，丹参含药血清下调Gli2蛋白的统计学分析；a，与空白对照组相比，P＜0.01；b，与瘦素组相比，P＜0.01；c，与瘦素+激动剂组相比，P＜0.01；d，与瘦素+丹参组相比，0.01＜P＜0.05Fig.3 The down-regulation of the expression of EVC2 and Gli2 in the Hh signaling pathway of HSCs by Danshen-containing serum.A，Western blot detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of EVC2 protein and Gli2 protein in HSCs；B，Stastic Danshen-containing serum inhibits the expression of EVC2 protein；C，anlysis shows Danshen-containing serum inhibits the expression of Gli2 protein；a，P＜0.01，compared with blank control group；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group；d，0.01＜P＜0.05，compared with leptin plus Danshen group

进一步的RT-PCR检测显示，HSCs内EVC2和Gli2 mRNA表达可被瘦素上调，Hh通路抑制剂和丹参均可明显抑制瘦素对HSCs内EVC2和Gli2 mRNA表达的上调作用；当用瘦素处理的HSCs同时用Hh信号通路激动剂处理后，其EVC2和Gli2 mRNA表达的上调极其显著，丹参对这种极强的上调作用也具有明显抑制效果（图4）。

讨 论

1 肝纤维化与HSCs的关系

图4　丹参含药血清抑制Hh信号通路中EVC2mRNA、Gli2mRNA在HSCs中的表达。A，丹参含药血清抑制Hh通路中EVC2 mRNA在HSCs中表达的RT-PCR检测；B，丹参含药血清抑制Hh通路中EVC2 mRNA在HSCs中的表达；C，丹参含药血清抑制Hh通路中Gli2 mRNA在HSCs中表达的RT-PCR检测；D，丹参含药血清抑制Hh通路中Gli2 mRNA在HSCs中的表达；a与空白对照组相比，P＜0.01；b与瘦素组相比，P＜0.01；c与瘦素+激动剂组相比，P＜0.01；d与瘦素+抑制剂组比较，P＞0.05Fig.4 The inhibition of the expression of EVC2mRNA，Gli2mRNA in the Hh signal pathway in HSCs by Danshen-containing serum.A，RT-PCR detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of EVC2mRNA in HSCsB，Danshen-containing serum inhibits the expression of EVC2 mRNA in HSCsC，RT-PCR detection for inhibition of Danshen-containing serum on the the expression of Gli2mRNA in HSCsD，Danshen-containing serum inhibits the expression of Gli2 mRNA in HSCs；a，compared with blank control group，P＜0.01；b，P＜0.01，compared with leptin group；c，P＜0.01，compared with leptin plus agonist group；d，P＞0.05，compared with leptin plus inhibitor group

肝纤维化是慢性肝损伤进展为肝硬化的重要阶段。HSCs的持续激活是肝纤维化发生、发展的中心环节［13］。本实验对研究尚少的Hh信号通路中EVC2和Gli2进行干预，观察丹参含药血清是否可以通过抑制EVC2和Gli2的表达从而抑制Hh信号通路的激活，使HSCs增殖受到抑制，从而抑制肝纤维化。

2 Hh信号通路在HSCs中的表达

Hh基因最早于1980年在果蝇中发现，之后在多种脊椎动物和人体中均发现其同源基因［14］。近年研究发现Hedgehog（Hh）信号通路在不同组织中的过度表达可导致多种肿瘤的发生和发展［15］。Hh信号通路在肝脏受到损伤后被激活。活化的Hh信号通路参与肝损伤修复反应的多个方面。Guy［16］等的研究表明，肝脏损伤的严重性与Hh信号通路的活化水平相关。在肝纤维化中，经典的Hh信号通路的活化依赖于Hh配体激活的Hh-Ptch-Smo-Gli。当Hh配体与Ptch结合时，解除Ptch对Smo的抑制。此时Evc2分子在初级纤毛上聚集表达，Evc2作用于Smo膜蛋白的下游，帮助Smo传递Hh信号并激活Gli，使Gli2解离［17］，并在核中聚集，转为较强的转录活性形式，从而促进 Hh信号通路下游 PDGF、bcl-2、VEGF、c-myc等靶标基因的异常表达并使HSCs被大量激活［18］。Evc2被证明是激活Gli成为活性状态的关键因子。Gli2是Hh信号通路的主要活化物［19］。Hh信号通路的激活可以促进大量的HSC活化增殖，使ECM过度沉积，形成肝纤维化。

3 丹参、抑制剂、秋水仙碱在Hh信号通路中的作用

本实验应用中药丹参、Hh信号通路抑制剂（环巴胺）干预瘦素组。丹参为唇形科植物丹参的根，始载于《神农本草经》，味苦，微寒，归心、肝经，可活血祛瘀、养心除烦、调经止痛。实验结果证明抑制剂、丹参都可抑制瘦素组Hh信号通路EVC2和Gli2的表达。同时应用丹参干预经激动剂刺激下充分活化的HSCs，仍然能有效抑制HSCs的增殖和EVC2和Gli2的表达。证明丹参可以对不同活化程度的Hh信号通路产生抑制作用。对比丹参与抑制剂对EVC2、Gli2表达的影响发现，EVC2mRNA和Gli2mRNA表达上，两者无明显差异，在EVC2蛋白、Gli2蛋白的表达上，抑制剂优于丹参。由此说明丹参具有类似抑制剂的抑制作用。但抑制剂与丹参相比，仍然具有劣势。抑制剂（环巴胺）是以Hh信号通路中Smo为靶点从而产生抑制作用［20］，但由于其具有致畸作用，其应用受到限制。虽然有由抑制剂（环巴胺）衍生出来的Smo小分子抑制剂IPI-926，但是由于未能得到预期效果，Infinity制药公司宣布暂时中止IPI-926的II期临床试验［21］。中药丹参不仅能针对肝纤维化中“瘀”的特点进行针对性治疗，同时具有价格低廉、安全、有效的特点。实验结果表明，丹参可以通过抑制EVC2和Gli2的表达从而抑制Hh信号通路表达和HSCs的活化增殖。可能为治疗肝纤维化提供新的思路。但仍需大量实验探索作用广泛、安全有效的中药在多靶点、多环节上对Hh信号通路的作用。

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Danshen-containing serum inhibits leptin-and hedgehog signaling pathway activation-induced upregulation of EVC2-and Gli2-expression in rat hepatic stellate cells

Han Shiqing1.2，Cao Wenfu1.2*，Feng Lili3
（1College of Traditional Chinese Medicine，2Laboratory of traditional Chinese medicine，3The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To observe the effect of the Danshen-containing serum on expressions of Ellis-van creveld syndrome protein 2（EVC2）and GLI family zinc finger protein 2（Gli2）in Hedgehog signaling pathways of hepatic stellate cells（HSCs）induced by leptin.Methods 40 SD rats were divided into 2 groups of 20，and the blood was collected after gastric perfusion for 10 days with Danshen water decoction or normal saline.The main components of tanshinol and tanshinone IIA in the Danshen-containing serum were determined by HPLC.The HSCs in the logarithmic growth phase were passaged into six-well cluster dishes，and then divided into six groups:blank control，leptin，leptin+inhibitor，leptin+Danshen，leptin+agonist，and leptin+agonist+Danshen.Each group was cultured in the medicated serum，and the cells were collected after 24 hours.Then MTT was used to test Danshen-containing serum’s effect on the proliferation of HSCs，immunofluorescence to test the expression of EVC2，Western blot to detect the expression of EVC2 and Gli2 proteins，and RT-PCR to test the expression of EVC2 mRNA and Gli2 mRNA in each group.Results Leptin and agonist stimulated the activation and proliferation of HSCs，and significantly increased the expression of EVC2 mRNA，Gli2 mRNA，EVC2 protein and Gli2 protein in HSCs.Inhibitor and Danshen inhibited the proliferation of HSCs，and significantly decreased EVC2 and Gli2 expressions，and such expressions decreased evidently when the agonist was intervened by the Danshen-containing serum.Conclusion The Danshen-containing serum can inhibit the activated HSCs by regulating the expressions of EVC2 and Gli2 in HSCs.

Hedgehog；HSCs；EVC2；Gli2；liver fibrosis

R285

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-12-25 〔修回日期〕2016-03-16

国家自然科学基金项目（81573860）

韩仕庆，女（1989年），汉族，硕士研究生

（To whom correspondence should be addressed）：caowenfu9316@163.com