肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠脊髓中自噬相关基因ATG5表达降低

刘永新管英俊*陈燕春王巧真接琳琳周风华张皓云卢 强

（潍坊医学院1组织学与胚胎学教研室，2病理学教研室，3人体解剖学教研室，潍坊 261053）



肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠脊髓中自噬相关基因ATG5表达降低

刘永新1管英俊1*陈燕春1王巧真3接琳琳1周风华2张皓云1卢 强2

（潍坊医学院1组织学与胚胎学教研室，2病理学教研室，3人体解剖学教研室，潍坊 261053）

目的 明确自噬相关基因ATG5在肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）转基因鼠脊髓中的表达情况.方法 取95d、108d和122d ALS转基因小鼠和野生型小鼠脊髓，应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR技术，检测ATG5在脊髓中的表达.结果 免疫荧光染色检测显示，在脊髓内，ATG5免疫反应产物主要定位于神经元；与同窝野生型小鼠比较，脊髓内ATG5免疫反应性在95d转基因小鼠无明显差异，而在108d和122d转基因小鼠明显降低.Western blot和RT-PCR分析显示，与同窝野生型小鼠比较，脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达水平在95d无明显变化，但在108d和122d时，转基因小鼠脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达均显著低于同窝野生型小鼠.结论 ATG5在ALS转基因鼠脊髓中表达降低，提示ATG5表达异常与ALS发生密切相关.

肌萎缩侧索硬化症；转基因小鼠；自噬；ATG5；脊髓

肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种由大脑和脊髓神经元退行性病变引起的慢性渐进性疾病，主要由于上/下运动神经元退行性障碍和肌肉纤维组织失神经支配，导致神经元死亡，从而出现肌肉萎缩，肌束震颤，语言障碍，吞咽困难，反射改变和痉挛，最终死于呼吸衰竭［1～2］。研究发现，ALS的病情进展主要与脊髓、脑干和大脑等运动中枢变性有关。部分ALS的发生与SOD1基因突变有关。近年来的研究发现，ALS患者的运动神经核存在自噬通路异常：SOD1突变体可以干扰体内溶酶体的转运，造成溶酶体缺陷，从而损坏线粒体［3］；我们前期研究发现，多种自噬因子在SOD1G93A突变的ALS转基因鼠脊髓中表达异常，如转录因子EB、Beclin1、ATG4B［4，5］。为了从自噬角度阐明ALS发病机制，我们检测自噬相关基因ATG5在ALS转基因鼠脊髓中的表达变化。

材料和方法

1 实验动物和标本制备

携带SOD1G93A突变基因小鼠，即ALS转基因（TG）小鼠购自Jackson Laboratories（Bar Harbor，ME）。将出生6周的ALS转基因雄性鼠与正常成年雌性鼠按1∶1合笼以繁殖ALS转基因小鼠。新生鼠4周后剪尾取DNA，参照本室以前方法［6］进行PCR基因型鉴定。选取成年ALS转基因鼠，随机分为发病早期（95d）、中期（108d）和晚期（122d）3组，每组以同窝同性别野生型（WT）小鼠做对照配对。

2 实验试剂

兔抗ATG5、小鼠抗GFAP多克隆抗体均购自Cell Signaling公司，小鼠抗NeuN、鸡抗GFAP多克隆抗体均购自Abcam公司，Alexa Fluor-488标记的羊抗小鼠IgG、Cy3标记的羊抗兔IgG、Alexa Fluor-488标记的驴抗鸡荧光IgY和HRP标记的羊抗兔、HRP标记的羊抗小鼠IgG均购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，小鼠抗GAPDH单克隆抗体购自于Proteintech Group公司。

3 免疫荧光染色

腹腔注射10%水合氯醛（0.35ml/100g体重）麻醉小鼠后，以含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，pH7.4）灌注固定，剥离脊髓，于同样固定液中4℃冰箱内后固定过夜，之后移入20%～30%蔗糖-PB溶液中（4℃）。沉糖后，OCT包埋脊髓，冷冻组织切片（厚度10μm）。PBS冲洗后，PBS稀释的3%Triton X-100，室温孵育，PBS清洗，加10%正常羊血清封闭，37℃孵育30min；甩去羊血清，滴加兔抗ATG5抗体（1：100）或兔抗ATG5（1：100）与鸡抗GFAP（1：300）的混合抗体、或兔抗ATG5（1：100）与鼠抗NeuN（1：1 000）的混合抗体，4℃过夜；PBS清洗3次，每次10min；滴加二抗为Cy3标记的羊抗兔IgG、或Cy3标记的羊抗兔IGg与Alexa Fluor-488标记的驴抗鸡IgY、或Alexa Fluor-488标记的羊抗小鼠IgG的混合二抗，37℃孵育40min；滴加Hoechst33258，避光孵育15min；用抗荧光淬灭封片液封片后，荧光显微镜下观察。对照组以PBS代替一抗，其他均相同。

4 免疫印迹检测

断头处死小鼠后取脊髓放入含1%PMSF的RIPA裂解液中冰上充分匀浆，12 000 r/min离心15min，取上清，BCA法测样品蛋白含量，调蛋白浓度到3 μg/μl。参照以前方法［7］进行ATG5 Western blot反应：配制12%SDS-DAGE凝胶，每孔上样90 μg蛋白，并在两边加样孔中加入蛋白Marker，浓缩胶恒压80V，40min，继续电泳分离胶120V恒压，60min；电泳结束后，将蛋白转至PVDF膜（100V恒压，90min），5%脱脂奶粉常温封闭2 h，将PVDF膜移至一抗ATG5（1：1000）、GAPDH（1：10000），4℃过夜；室温孵育二抗2 h，淋洗ECL胶片曝光。

5 RT-PCR检测

总RNA的提取：断头处死小鼠取转基因鼠脊髓，加入1ml Trizol冰上充分匀浆；加入250 μl充分震荡混匀，静止5min，4℃，12 000r/min离心15min；取上清移入新的EP管，加入1ml异丙醇颠倒混匀，-20℃过夜，4℃，12000r/min离心10min，弃上清。加入1ml 75%乙醇震荡混匀，4℃，8 000r/min离心5min，弃上清。加入1ml无水乙醇震荡混匀，4℃，8 000r/min离心5min，弃上清干燥5min。加入4 μl DEPC水，检测RNA浓度。

逆转录反应：将离心管冰浴，加入2μg RNA，2μl oligdT，5μl dNTP混合物（2.5mmol/L），DEPC水补至14.5μl，70℃反应5min；在同一管中依次加入5μl的5×缓冲液，MMLV逆转录酶1μl，RNase 0.5μl，DEPC水4μl，42℃ 60min、95℃ 5min，-70℃保存。

PCR扩增反应：ATG5上游引物：5′-ATATCAGACCACGACGGAGCG-3′，ATG5下游引物：3′-CAGCATTGGCTCTATCCCGTG-5′；β-actin上游引物：5′-CGTTGACATCCGTAAAGACC-3′，β-actin下游引物：3′-ACAGTCCGCCTAGAAGCAC-5′。以0.5μl cDNA为模板，ATG5与β-actin上下游引物分别 0.5μl，PCR反应条件：94℃预变性，94℃变性，58℃退火，72℃延伸，循环30次。取PCR产物，跑电泳。

6 统计学分析

应用IPP6.0图像分析软件对ATG5 Western blot和RT-PCR结果进行定量测定：测量免疫印迹显示的ATG5阳性条带和GAPDH阳性条带的IOD值以及PCR显示的ATG5阳性条带和β-actin阳性条带的IOD值，ATG5的表达水平以ATG5/GADPDH和ATG5/β-actin IOD比值表示，数据表示为均数±标准差，用SPSS20.0按独立样本进行t检验。

结 果

免疫荧光检测显示，ATG5主要表达在NeuN标记的神经元胞质中（图1），在GFAP标记的星形胶质细胞中不表达（图2）。不同时期的野生型和ALS转基因小鼠脊髓的腹角、背角和中央管区均可检测到ATG5阳性细胞（图1）。与同窝野生型小鼠相比，ALS转基因小鼠脊髓中ATG5免疫反应性在95d时无明显差异，在108d和122d时明显减弱（图3）

图1　ATG5在小鼠脊髓神经元（NeuN阳性）内表达。DH，背角；CC，中央管；VH，腹角；WT，野生型小鼠；TG，ALS转基因小鼠；标尺，50μmFig.1 Expression of ATG5 in the neurons（NeuN positive）of the mouse spinal cord.DH，dorsal horn；CC，central canal；VH，ventral horn；WT，wild type mice；TG，ALS transgenic mice；scale bar，50μm

图2　ATG5不在小鼠脊髓星形角质细胞（GFAP阳性）内表达。DH，背角；CC，中央管；VH，腹角；WT，野生型小鼠；TG，ALS转基因小鼠；标尺，50μmFig.2 No expression of ATG5 in the astrocytes GFAP positive）of the mouse spinal cord.DH，dorsal horn；CC，central canal；VH，ventral horn；WT，wild-type mice；TG，ALS transgenic mice；scale bar，50μm

图　3 ALS转基因小鼠脊髓内ATG5免疫反应性变化的免疫荧光检测。WT，野生型小鼠；TG，ALS转基因小鼠；标尺，50μmFig.3 Detection of changes in ATG5-immunoreactivities in the spinal cord of ALS-transgenic mice.WT，wild type mice；TG，ALS transgenic mice；scale bar，50μm

Western blot分析显示，在ALS鼠与同窝野生鼠脊髓全蛋白中均可检测到ATG5阳性条带。与同窝野生鼠相对比，ALS转基因小鼠脊髓内ATG5蛋白水平在95d时呈上升趋势，但差异无统计学意义；在108d和122d时，ATG5蛋白水平明显降低（图4A、4B）。

为了明确上述ATG5免疫反应性和蛋白水平的改变是否由其表达改变所致，继而应用RT-PCR技术对ATG5 mRNA水平进行了检测。ALS转基因小鼠与同窝野生型小鼠脊髓中均可检测到ATG5 mRNA阳性条带。对比同窝野生型小鼠，ALS转基因小鼠脊髓中ATG5 mRNA水平在95d时无明显差异，而在108d和122d时则明显降低（图4C、4D），表明在ALS发病中晚期小鼠脊髓中ATG5表达水平明显降低。

图4　WT和ALS转基因鼠脊髓中ATG5表达。A，WT和ALS小鼠脊髓中ATG5蛋白水平的Western blot检测；B，WT和ALS小鼠脊髓中ATG5蛋白水平Western blot检测的统计学分析；C，WT和ALS小鼠脊髓中ATG5 mRNA水平的RT-PCR检测；D，WT和ALS小鼠脊髓中ATG5 mRNA水平RT-PCR检测的统计学分析；*，与WT小鼠比较，0.01＜P＜0.05Fig 4 Expression of ATG5 in the spinal cord of wild-type and ALS transgenic mice.A，Western blot detection of ATG5 protein in the spinal cord of wild-type and ALS transgenic mice；B，statistic analysis of ATG5 protein detected by Western blot in the spinal cord of wild-type and ALS transgenic mice；C，RT-PCR detection of ATG5 mRNA in the spinal cord of wild-type and ALS transgenic mice；D，statistic analysis of ATG5 mRNA detected by RT-PCR in the spinal cord of wild-type and ALS transgenic mice；*，0.01＜P＜0.05，compared with WT mice

讨 论

自噬是一个保守的、在饥饿和应激刺激下基因控制的分解代谢反应。在自噬中，细胞在溶酶体中靶向细胞内蛋白和细胞器降解，通过自身消化产生能量并减轻应激诱导细胞器的损伤，从而促进细胞存活［8，9］。自噬可促进细胞存活，但是过度自噬本身也会导致细胞死亡。自噬的形成由多个自噬基因调节，其中ATG5是重要的自噬基因［10］。

ALS是一种选择性损害脊髓前角运动神经元的神经退行性疾病，表现为加重性的肌肉无力、萎缩。ALS的发病过程中主要通过未折叠蛋白反应，促使错误折叠以及未折叠蛋白不能按正常途径移出内质网，而堆积在内质网腔，从而上调靶基因转录，下调蛋白翻译水平。神经退行性疾病多是由于蛋白错误折叠、构象改变而暴露出那些正常情况下隐藏于蛋白内部的疏水性残基。异常蛋白的不断聚集，从而加速疾病的进展。ATG5作为自噬家族中的一员，主要存在方式是与ATG12相结合，形成自噬体前体，影响LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的修饰，诱导自噬，使得ATG5基因表达受到抑制，LC3-Ⅱ的产生也被终止，自噬发生因此被抑制。自噬对于神经退行性疾病有双重作用，一方面它可以加快疾病发生发展，另一方面又可以起到保护作用［11］。神经退行性疾病早期，自噬激活可以加快清除变性的蛋白。亨廷顿病中，自噬可降解突变蛋白小片段的聚集，从而起到保护作用［12］。但是随着疾病加剧，越来越多异常蛋白聚集，溶酶体蛋白酶不足以将其降解，由于自噬持续性激活细胞，导致细胞程序性死亡，从而加剧神经退行性病变。另一方面，在帕金森（Parkinson's disease，PD）患者中，ATG5基因表达水平显著升高，表明PD患者可改变ATG5蛋白水平，改变自噬发展，加速PD发病进程［13］。

本实验从蛋白和基因水平检测了自噬相关基因ATG5在脊髓中的表达变化。免疫荧光双标结果显示，ATG5主要表达于神经元内，不表达于GFAP标记的星形胶质细胞中，提示自噬可能主要发生在神经元中。RT-PCR和蛋白免疫印迹结果显示，ATG5 mRNA和蛋白在95d变化不明显，在108d、122d表达均降低，表明在发病早期，自噬活动变化不明显，在发病中、晚期，出现ATG5蛋白下调，自噬减弱，异常聚集相关蛋白清除减少，加剧了神经元的变性。本实验结果表明，在ALS转基因鼠脊髓中ATG5出现异常变化，与ALS发病密切相关。

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Decreased expression of autophagy related gene ATG5 in the spinal cord of transgenic mice with amyotrophic lateral sclerosis

Liu Yongxin1，Guan Yingjun1*，Chen Yanchun1，Wang Qiaozhen3，Jie Linlin1，Zhou Fenghua2，Zhang Haoyun1，Lu Qiang2
（1Histology and Embryology Department，2Pathology department，3Human Anatomy Department，Weifang Medical University，Weifang 261053，China）

Objective To define the expression of autophagy related gene ATG5 in the spinal cord of transgenic mice with amyotrophic lateral sclerosis.Methods The expression of ATG5 in the spinal cord of ALS transgenic mice and wild-type mice at the age of 95d，108d and 122d was detected by immunohistochemistry，Western blot and RT-PCR.Results Immunofluorescence staining showed that ATG5 immunoreactive products were mainly located in the neurons of the spinal cord.Compared with wild-type mice，no significant change was observed in ATG5 at 95d，but the immunoreactivity was decreased at 108d and 122d in ALS transgenic mice.Western blot and RT-PCR showed that ATG5 mRNA and protein showed no significant change in the spinal cord of ALS transgenic mice at 95d，but decreased at 108d and 122d，compared with those of wild-type mice.Conclusion The expression of ATG5 is decreased in the spinal cord of ALS transgenic mice，which may be closely associated with the pathogenesis of ALS.

amyotrophic lateral sclerosis；transgenic mice；autophagy；ATG5；spinal cord

R329

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-02-21 〔修回日期〕2016-04-28

国家自然科学基金（81271413；81401066）；山东省科技发展计划项目（2012GSF11827）；山东省自然科学基金（ZR2012HQ021）

刘永新，女（1988年），汉族，研究生

（To whom correspondence should be addressed）：guanyj@wfmc.edu.cn