乳腺癌中高水平乙酰肝素酶促进肿瘤微血管和微淋巴管生成

岳喜成李　靖安程程李德群胡仲翔

（1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科三病区；2安徽省立医院，蚌埠 233000）



乳腺癌中高水平乙酰肝素酶促进肿瘤微血管和微淋巴管生成

岳喜成1*李靖1安程程1李德群1胡仲翔2

（1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤外科三病区；2安徽省立医院，蚌埠 233000）

目的 分析乳腺癌组织中乙酰肝素酶（heparinase，HPA）的表达与临床病理指标、微血管密度（micro vessel density，MVD）和微淋巴管（micro lymphatic density，MLD）之间的相关性及与预后的关系，探讨HPA在乳腺癌发生、发展及转移中的作用。方法 应用免疫组织化学方法检测浸润性乳腺癌组织中HPA水平及CD34和D2-40分别标记的微血管和微淋巴管，观察乳腺癌组织中HPA水平与MVD及MLD的关系，并与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、腋淋巴结转移、临床分期进行相关分析。结果 在乳腺癌组织中，HPA免疫反应性明显增强，阳性率明显高于癌旁组织，以阳性CD34为标志的MVD增高，以阳性D2-40为标志的MLD降低；HPA阳性乳腺癌组织中MVD和MLD明显高于HPA阴性乳腺癌组织；乳腺癌中HPA水平与肿瘤大小、组织学病理学级别和临床分期呈正相关。结论 HPA与乳腺癌的微血管和微淋巴管生成密切相关，HPA可以作为评价乳腺癌浸润和转移情况的重要指标。

乳腺癌；乙酰肝素酶；微血管密度；微淋巴管密度

乳腺癌是威胁全世界女性健康第一位恶性肿瘤，发病率每年约以2%的速度递增，全世界每年约有140万妇女发生乳腺癌，50万妇女死于乳腺癌。我国目前乳腺癌的发病率也较前明显升高，发病率增速居世界第一，发病年龄较前提前，其中远处转移是乳腺癌治疗失败的关键。肿瘤转移是一个涉及多个步骤的复杂过程，必须完成两个关键步骤：一是突破由基底膜（basement membrane，BM）和细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）构成的组织屏障，二是新生血管、淋巴管的形成，一些临床研究发现，肿瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）与肿瘤转移和患者预后密切相关；随着肿瘤微血管密度的增大，肿瘤侵袭转移等恶性潜能也明显增强［1］。此外腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者的癌周组织微淋巴管密度（micro lymphatic density，MLD）明显高于无腋窝淋巴结转移的患者［2］。HPA被证明是唯一一种可降解哺乳动物ECM和BM中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteogycans，HSPGs）中硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）的内源性糖苷内切酶，由于在肿瘤细胞的侵袭和转移具有重要作用，以其作为肿瘤治疗靶点成为新的研究热点。CD34是一种比较特异的血管内皮标记物，而D2-40是相对特异的淋巴管内皮标记物［3］。本研究通过检测乳腺癌组织及癌旁组织中HPA的表达状况，并结合MVD和MLD，探讨肝素酶与乳腺癌转移和浸润的关系。

材料和方法

1 病例资料

选取蚌埠医学院第一附属医院2006年1月-2010年12月获得随访资料的浸润性乳腺癌患者200例，找出相应的石蜡包埋的肿瘤组织和癌旁组织，所有病理诊断为乳腺浸润性导管癌。患者年龄29～80岁，中位年龄51.4岁。均行乳腺癌改良根治术，术前未接受化疗、放疗及其他抗癌治疗，并且术前相关检查未见肝、肺以及骨转移。临床分期采用TNM分期法进行分期，其中Ⅰ期71例，Ⅱ期69例，Ⅲ期70例。组织学分级Ⅰ级57例，Ⅱ级82例，Ⅲ级61例。有淋巴结转移者104例，无转移96例。肿瘤直径≤2cm者91例，＞2cm者109例。同时选取相应的癌旁组织。

2 试剂

HPA山羊多克隆抗体、HPA（SC.14900）及SABC试剂盒购自Santa Cruz公司，CD34及D2-40单克隆抗体购于武汉博士德公司，通用型二步法PowerVisionTM试剂盒（IgG抗体HRP多聚体，PV-6002）购自北京中山公司。

3 免疫组织化学染色

HPA检测采用SABC法，操作步骤按说明书进行；CD34、D2-40检测采用通用型二步法进行，切片常规脱蜡，水化，用3%过氧化氢去除内源性酶，微波抗原修复。滴加一抗（小鼠抗人CD34单克隆抗体）4℃过夜，PBS冲洗后滴加二抗（山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体）PowerVisionTM孵育30min，DAB显色。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

4 结果判定

HPA阳性判断标准：胞质中出现棕黄色颗粒即为阳性细胞。高倍镜下取4个视野各计数200个细胞，按阳性细胞所占百分比分为：-，无肿瘤细胞染色；+，5%～20%的肿瘤细胞染色；++，21%～50%的肿瘤细胞染色；+++，＞50%的肿瘤细胞染色。

微血管密度计数：于低倍镜下（4倍物镜）观察整张切片血管分布情况后，选择癌灶周围间质血管密集区，中倍镜下（20倍物镜）视野下计算5个不同区域的微血管数，取其平均值为MVD（微血管数/中倍视野）。计数时管腔直径≤50um者判断为微血管，＞50um或管壁含肌层者不作为微血管计算。另单个染色细胞或成群无管腔染色细胞也作为单个微血管计数。

微淋巴管密度计数：于低倍镜下观察整张切片血管分布情况后，选择癌灶周围间质血管密集区，200倍视野下计算5个不同区域的微淋巴管数，取其平均值为MLD（微淋巴管数/中倍视野）。计数时，管腔直径≤50μm者判断为微淋巴管，＞50μm不作为微淋巴管计算。

5 统计分析

采用SPSS18.0统计软件进行数据分析，所得MVD和MLD数据用x±s表示，资料采用χ2检验及校正χ2检验或Fisher精确概率法，HPA与MVD、MLD的关系采用t检验。P＜0.05为具有明显统计学差异。

结 果

1 乳腺癌组织中HPA免疫组织化学表达增强

免疫组织化学染色结果显示，HPA主要在腺细胞胞质内表达，部分血管内皮细胞内也有表达。在200例癌周正常组织中，HPA免疫反应呈强阳性（+++）、中度阳性（++）、弱阳性（+）和阴性者（-）分别为3例（1.5%）、3例（1.5%）、17例（8.5%）和 177例（88.5%）；在乳腺癌组织中，HPA免疫反应性较癌旁组明显增强（图1，表1）：在200例患者的癌组织中，HPA免疫反应呈强阳性（++ +）、中度阳性（++）、弱阳性（+）和阴性者（-）分别为43例（21.5%）、48例（24.0%）、40例（20.0%）和69例（34.5%）。

图1　乳腺癌组织及癌旁组织中HPA免疫组织化学染色。A，乳腺癌组织，箭示HPA阳性细胞；B，癌旁组织H，箭示HPA阳性细胞；比例尺，100μmFig.1 Immunohistochemical stain for HPA in the breast cancer tissues and the paracancerous tissue.A，breast cancer tissue，arrow indicating HPA positive cell；B，paracancerous tissue，arrow indicating HPA positive cell；scale bar，100μm

表1　乳腺癌与癌旁组织HPA阳性率比较Table 1 Comparison of HPA positive rates in the breast cancer and paracarcinoma tissues

2 乳腺癌组织中MVD增高MLD降低

免疫组织化学染色显示，在乳腺癌组织间质中，CD34阳性反应产物位于内皮细胞胞质，D2-40阳性产物定位于内皮细胞胞质和胞膜；癌旁组织中CD34、D2-40免疫反应性较弱（图2）。对分别被CD34和D2-40阳性标记微血管进行计数统计显示，在乳腺癌组织中，MVD明显高于癌旁组织，而MLD低于癌旁组织（表2）。

图2　乳腺癌组织及癌旁组织间质微血管CD34及D2-40免疫组织化学表达。A1，乳腺癌组织，箭示CD34染色；A2，癌旁组织，箭示CD34染色；B1，乳腺癌组织，箭示D2-40染色；B2，癌旁组织，箭示D2-40染色；比例尺，100μmFig.2 Immunohistichemical expression of CD34 and D2-40 in the breast cancer tissues and paracancerous tissue.A1，breast cancer tissue，arrow showing CD34 positive staining；A2，paracancerous tissue，arrow showing CD34 positive staining；B1，breast cancer tissue，arrow showing D2-40 positive staining；B2，paracancerous tissue，arrow shows D2-40 positive staining；scale bar，100，μm

表2　乳腺癌组织与癌旁组织MVD和MLD数比较Table 2 Comparison of MLD and MVD in breast cancer and paracarcinoma tissues

3 乳腺癌组织中MVD和MLD与HPA免疫反应性呈正相关

在200例乳腺癌组织中，131例HPA阳性者MVD为63.30±10.21，MLD为10.05±1.66，69例HPA阴性者MVD为33.18±13.45，MLD为2.16± 1.21，HPA阳性者MVD和MLD明显高于HPA阴性者，相关分析显示两者呈显著正相关（表3）。由此提示乙酰肝素酶的水平与肿瘤微血管和微淋巴管生成关系密切。

表3　乳腺癌组织中HPA水平与MVD和MLD的关系Table 3 Relationship between HPA level and MVD and MLD in the breast cancer

4 乳腺癌中HPA水平与肿瘤大小、组织学级别和临床分期呈正相关

癌组织中HAP免疫反应性强弱与乳腺癌临床特征的关系分析显示，乳腺癌患者的肿瘤直径、组织学分级、腋淋巴结状况、临床分期有关，与患者年龄无关。肿瘤越大、组织学级别越高、临床分期越晚，HPA阳性率就越高；腋淋巴结转移组HPA的阳性率显著高于腋淋巴结阴性组（表4）。

讨 论

人类HPA是一种哺乳动物的β-葡萄糖醛酸内切酶，有2种基因亚型，即HPA-1和HPA-2，HPA-1和HPA-2在正常和异常组织中的表达有显著差异，生理情况下，HPA-1的表达被严格限制在胎盘滋养层、血道细胞及角质形成细胞，而在几乎所有的人类恶性肿瘤中均有表达［4］，HPA-2主要在正常的脑、乳腺、前列腺、睾丸和子宫组织中有较高的表达，而在异常组织中目前仅发现在胰腺癌组织中有较高的表达［4，5］。我们通常所说的HPA主要是指HPA-l基因表达的酶蛋白，其在炎症、损伤、以及恶性肿瘤生长与转移等多种病理改变中普遍存在。

表4　乳腺癌组织中HPA免疫反应性与临床病理参数之间的关系Table 4 Relationship between HPA immunoreactivity and clinical pathological parameters in the breast cancer

HPA主要通过以下几个途径促进肿瘤细胞的侵袭及转移：①HPA可直接降解ECM和BM的HSPGs而破坏ECM及BM的完整性；②HPA裂解HSPGs后产生的HS片段可激活HS的受体CD44v3（CD44 variantexon3），发出细胞内迁移信号，促使细胞变形、运动，从而促进肿瘤细胞的扩散与转移［6］；③HPA促进内皮下尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，u-PA）及组织型纤溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，t-PA）的释放，使纤溶酶原激活，从而促进ECM及BM的降解［7］；④HPA降解HSPGs后的产物可以抑制激活的T淋巴细胞，降低机体对肿瘤的免疫监视，使肿瘤细胞更易侵袭与转移；⑤介导细胞黏附：表达于细胞表面的HPA可介导细胞对ECM及BM的黏附，引起细胞在基质中扩散以及促进BM的重建，帮助细胞侵入血管和淋巴管［8］。此外，Vlodoansky等［9］发现，在体外将EBT淋巴瘤细胞传染HPA基因后，其血管和淋巴管生成能力均明显提高。

近年来，乳腺癌的发病率逐渐升高，而转移则是患者死亡的主要因素，因此探讨乳腺癌转移的相关机制以及寻找控制转移的相关靶点治疗乳腺癌的重要途径。目前肿瘤源性的血管和淋巴管生成成为研究热点，而其与HPA之间的相关性也越来越受到重视。

本实验采用CD34、D2-40抗体研究乳腺恶性肿瘤及癌旁组织中的MVD、MLD变化，结果发现乳腺恶性肿瘤中及癌旁组织中的MVD、MLD存在显著差异，乳腺浸润性导管癌中MVD明显高于癌旁组织，癌旁组织中MLD明显高于乳腺癌组织。我们分析认为肿瘤细胞自身能够分泌促血管生长因子，一方面为自身生长提高养分，另一方面促使肿瘤细胞通过血液转移至其他器官；而乳腺癌组织中的淋巴管系统在肿瘤发展过程中因浸润受阻，可能是由于该区域内癌细胞增殖过快、细胞间产生高压作用，导致淋巴系统无法延伸，新生淋巴管受压塌陷、萎缩，成为无功能淋巴管；而同一阶段在癌巢周边区域，新生淋巴管数目明显增多，且多为扩张状，预示淋巴系统增生活跃，为肿瘤细胞周边转移等提供着有利条件。同时通过研究HPA免疫组织化学表达水平与MVD、MLD之间的关系，发现在HPA阳性乳腺浸润性导管癌中，MVD和MLD明显高于HPA阴性者，表明HPA对乳腺癌血管和淋巴管生成有重要的作用。我们的实验结果也显示，在乳腺浸润性导管癌中HPA的阳性表达率明显高于癌旁正常乳腺组织；同时，肿瘤的分期越晚、癌分化程度越低、直径越大其HPA的阳性表达率就越高。有淋巴结转移患者的阳性表达率也高于无淋巴结转移者，提示HPA的表达与乳腺癌的浸润转移密切相关。因此根据本实验结果，我们认为HPA与乳腺癌的血管、淋巴管生成和浸润转移密切相关；HPA可以作为判断乳腺癌浸润转移的一个重要指标。

［1］孙慧，战忠利，吴洁.人乳腺癌和癌旁组织中血管内皮生长因子与微血管密度的表达及其临床意义.中华实验外科杂志，2002，19（1）:29-30.

［2］Xiaojing Guo，Ling Chen，Ronggang Lang et al.Relationship between lymphatic vssel density and lymph node metastasis of invasive micropapillary carcinoma of the breast.J Clin Oncol，2006，3（1）:15-19.

［3］Rose AE，Christos PJ，Lackaye D et al.Clinical relevance of detection of lymphovascular invasion in primary melanoma using endothelial markers D2-40 and CD34.Am J Surg Pathol，2011，35（10）:1441-1449.

［4］Zhang W，Chan H，Wei L，et al.Overexpression of heparanase in ovarian cancer and its clinical significance.Oncol Rep，2013，30（5）:2279-2287.

［5］Ostapoff K T，Awasthi N，Cenik B K，et al.PG545，an angiogenesis and heparanase inhibitor，reduces primary tumor growth and metastasis in experimental pancreatic cancer. Mol Cancer Ther，2013，12（7）:1190-1201.

［6］Iriyama S，Matsunaga Y，Takahashi K，et al.Activation of heparanase by ultraviolet B irradiation leads to functional loss of basement membrane at the dermal-epidermal junction in human skin.Arch Dermatol Res，2011，303（4）: 253-261.

［7］Gonzalez-Alva P，Kikuchi K，Miyazaki Y，et al.Expression of heparanase:a possible role in invasiveness and aggressive clinical behavior of amelob lastomas.J Oral Sci，2010，52（1）:39-47.

［8］Vlodavsky I，Blich M，Li J P，et al.Involvement of heparanase in atherosc leros is and other vessel wall pathologies. Matrix Biol，2013，32（5）:241-251.

［9］Vreys V，David G.Mammalian heparanase:what is the message？J Cell Mol Med，2007，11（3）:427-452.

High level of heparinase promotes the formation of tumor microvascular and lymphatic vessels in breast cancer

Yue Xicheng1*，Li Jing1，An Chengcheng1，Li Dequn1，Hu Zhongxiang2
（1Third Department of Tumor Surgery，First Affilicated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu；2Anhui Provincial Hospital，Bengbu 233000，China）

Objective To explore the connection among clinical pathological indicators，microvessel density（MVD），micro lymphatic density（MLD）and the expression of heparinase（HPA）in breast cancer tissue，we analyze the relationship between HPA and prognosis，and explore the role of HPA in breast cancer occurrence，development and metastasis.Methods Immunohistochemical markers HPA，CD34 and D2-40 were applied to observe the relationship between the expression of MVD，MLD and HPA in breast cancer tissue.Their relationships with the age of patients，tumor size，histological grade，axillary lymph node metastasis，and clinical stage were analyzed.Results In the breast cancer tissues，the level of HPA increased significantly，and the positive rate was significantly higher than that in the adjacent tissues，with MVD as the sign of CD34 increased and MLD as the sign of D2-40 decreased. MVD and MLD in HPA positive breast cancer tissues were significantly higher than those in HPA negative breast cancer tissues.The level of HPA in breast cancer was positively correlated with tumor size，histological grade and clinical stage.Conclusion HPA is closely related to MVD and MLD in breast cancer；HPA can be used as an important index for evaluating the infiltration and metastasis of breast cancer.

breast cancer；heparinase；microvascular density；microlymphatic vessel density

R737.9

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-05-05 〔修回日期〕2016-2-27

岳喜成，男（1972年），汉族，副主任医师

（To whom correspondence should be addressed）：yuexicheng@163.com