胃腺癌中Twist、Snail与KAI1的免疫反应性及其临床意义

陆国玉吴晓飞张晓华周 蕾

（蚌埠医学院第一附属医院1急诊科，2临床病理科，蚌埠 233003）



胃腺癌中Twist、Snail与KAI1的免疫反应性及其临床意义

陆国玉1吴晓飞1张晓华1周 蕾2*

（蚌埠医学院第一附属医院1急诊科，2临床病理科，蚌埠 233003）

目的 检测原发性胃腺癌（gastric adenocarcinoma，GAC）中上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）相关标记物Twist和Snail蛋白以及肿瘤转移抑制因子KAI1水平，并分析它们之间的相互关系以及临床意义。方法通过免疫组织化学ElivisionTMplus法检测261例GAC和80例正常胃黏膜组织中Twist、Snail和KAI1蛋白的免疫反应性。结果 Twist和Snail在GAC组织中的免疫反应阳性率显著高于其在对照组中的阳性率；KAI1蛋白在GAC组织中的免疫反应阳性率显著低于其在对照组中免疫反应阳性率。Twist和Snail蛋白免疫反应阳性率与GAC组织的浸润深度、临床病理分期和淋巴结转移均显著相关；KAI1蛋白的免疫反应阳性率与GAC肿瘤组织的分化程度、浸润深度、临床病理分期及淋巴结转移显著相关。Kaplan-Meier生存分析显示，Twist和Snail蛋白免疫反应阳性组患者的总体生存时间明显短于其阴性组患者，而KAI1蛋白免疫反应阳性组的患者总体生存时间明显长于其阴性组患者。Spearman相关分析显示，KAI1蛋白与Twist和Snail蛋白的免疫反应性之间呈负相关，Twist和Snail的免疫反应性呈正相关。COX多因素回归分析表明Twist和KAI1蛋白的免疫反应阳性以及pTNM分期是影响GAC患者生存的独立预后因素。结论 Twist、Snail水平升高和KAI1水平降低可能参与了GAC的浸润及转移过程；联合检测Twist、Snail和KAI1的免疫反应性对GAC患者的肿瘤进展及预后判断有重要意义。

胃肿瘤；Twist；Snail；KAI1；预后

胃癌的发病率在恶性肿瘤中位于第五位，中国是胃癌高发国家，占全球新发病例的40%［1-2］。大多数胃癌患者的术后治疗效果不佳，转移和复发是其主要原因。上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）与转移过程非常相似。所谓EMT过程是指上皮细胞在一些特定的生理或病理情况下向间充质细胞转化，上皮细胞的极性和黏附性降低或丧失、细胞骨架重组，同时伴有上皮细胞相关表型（例如CK、E-cadherin等）丧失，而间充质相关表型（例如vimentin、Twist、Snail等）表达增多［3］。这些均导致肿瘤细胞的运动能力增强而易于脱离母体造成侵袭和转移。Twist是EMT的关键标记物，是具有bHLH（basic helix-loop-helix，bHLH）结构的转录因子［4］，其在肿瘤组织中表达增高往往意味着肿瘤细胞易于侵袭、转移及预后不良［5-7］。转录因子Snail是EMT过程中另一个关键因子，是具有锌指结构的超家族中的关键成员，其家族成员包括Snail（Snail1）、Slug（Snail2）和Smug（Snail3）［8］。Snail可以通过抑制CDH1的转录而导致E-cadherin的表达降低或缺失，从而促进EMT的形成［9］。Snail表达增高与肿瘤侵袭和复发有关［10］。KAI1是一种肿瘤转移抑制因子，其表达降低或缺失促进肿瘤的侵袭及转移。KAI1最早是在前列腺癌中被发现的，是前列腺癌特异性的转移抑制基因。近20年来在其它多种肿瘤中发现KAI1的表达是降低或缺失的，而其表达降低或缺失往往与肿瘤的浸润、转移及预后［11-13］相关。尽管TNM分期作为原发性胃腺癌（gastric adenocarcinoma，GAC）患者治疗依据已得到广泛的认可，但TNM分期不能反映每一个GAC组织的生物学行为，因此迫切需要寻找到能够反映GAC生物学行为、且能够对TNM分期作出有益补充的生物学标记。本研究通过免疫组织化学ElivisionTMplus法研究检测261例GAC患者肿瘤组织中Twist、Snail和KAI1蛋白的免疫反应性，分析它们之间的关系，旨在寻找能够预测GAC患者浸润、转移及预后的新指标。

材料和方法

1 一般资料

收集蚌埠医学院第一附属医院临床病理科2004年1月～2005年12月存档石蜡包埋GAC组织（术前均未行放、化疗及生物治疗等抗肿瘤治疗）261例和正常胃黏膜组织80例作回顾性研究，所有病例都有完整的临床病理及随访资料。入选病例随访至患者死亡或截止至2013年4月，随访时间为8～110月。所有GAC诊断均在本院病理科证实。临床病理资料包括GAC患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤类型、浸润深度、分化程度、淋巴结转移与否及临床病理分期等。

80例对照组正常胃黏膜组织均取自远离GAC肿块5.0cm，且经病理科H&E染色证实为正常胃黏膜组织。

2 试剂

兔抗人Twist多克隆抗体及鼠抗人Snail单克隆抗体均购自美国Abcam公司；鼠抗人KAI1单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；ElivisionTMplus及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

3 免疫组织化学染色

所有标本均经10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，以4μm厚连续切片、烤干，最后通过二甲苯和浓度梯度乙醇溶液脱蜡至水洗。免疫组织化学操作均根据试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以相应动物的IgG替代一抗作阴性对照。

4 结果判定与统计分析

Twist是以细胞质出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，也会出现胞核着色；Snail是以细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性；KAI1是以细胞膜和浆出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。采取二次计分法，每例标本随机计数10个高倍视野（×400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比并计分；分析染色强度并计分。具体步骤见参考文献［14］。最后将阳性细胞数得分和染色强度得分的乘积作为表达判断结果，若积分≥3分为阳性，＜3分为阴性。免疫组化标记结果由两位病理医师通过独立双盲法判定。

采用SPSS20.0统计软件包进行统计分析。Twist、Snail和KAI1蛋白免疫反应阳性组与阴性组的生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较用logrank检验；多因素分析采用COX多因素回归模型进行分析。在GAC肿瘤组织中，Twist、Snail和KAI1蛋白的免疫反应性与正常胃黏膜组织、各临床病理参数的相关性采用Χ2、Spearman等级相关检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Twist免疫反应性增高促进GAC的浸润和转移

Twist蛋白在对照组中的免疫反应阳性率为2.5%，在GAC组中的免疫反应阳性率为62.1%（图1A，图1B），GAC组较对照组显著升高。Twist蛋白的阳性率与GAC肿瘤组织的浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期均有关。Twist蛋白的阳性率与GAC患者的性别、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤类型及分化程度等无关（表1）。

图1　Twist、Snail和KAI1在GAC和对照组中的免疫组织化学染色。A，Twist在GAC组织中的阳性染色，主要定位于细胞浆（中分化）；B，Twist在对照组中的阴性染色；C，Snail在GAC组织中的阳性染色，主要定位于细胞核（低分化）；D，Snail在对照组中的阴性染色；E，KAI1在GAC中的阴性染色（中分化）；F，KAI1在对照组中的阳性染色，主要定位于细胞膜和细胞浆。比例尺=100μmFig.1 Immunostaining of Twist、Snail、KAI1 in the GAC and control tissues.A，Positive immunoreactivity of Twist in the cytoplasm of GAC（moderate differentiation）；B，Negative immunoreactivity of Twist in the control group；C，Positive immunoreactivity of Snail in the nucleus of the GAC（poor differentiation）；D，Negative immunoreactivity of Snail in the control group；E，Negative immunoreactivity of KAI1 in the GAC（moderate differentiation）；F，Positive immunoreactivity of KAI1 in the membrane and cytoplasm of the control groups.Scale bar，100μm

2 Snail的免疫反应性增高促进GAC的浸润和转移

对照组中Snail蛋白的免疫反应阳性率为5.0%，GAC组中的免疫反应阳性率为60.9%（图1C，图1D），GAC组较对照组显著升高。且Snail蛋白的阳性率与GAC患者的性别、年龄、肿瘤位置及肿瘤类型等无相关性。Snail蛋白的阳性率与GAC组织的分化程度、淋巴结转移与否及临床病理分期高低等均相关（表1）。Snail蛋白阳性率与GAC的肿瘤大小有关。

表1　GAC中Twist、Snail和KAI1的免疫反应性以及与临床病理因素之间的关系Table 1 Correlation of Twist，Snail，and KAI1 immunoreactivity and clinicopathological characteristics in GAC

3 KAI1的免疫反应性降低促进GAC的浸润和转移

KAI1蛋白在对照组和GAC组中的免疫反应阳性率分别为100%和38.3%（图1E，图1F），GAC组较对照组显著降低。KAI1蛋白的免疫反应阳性率与GAC肿瘤组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期均有关，与GAC患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置及肿瘤类型等无关（表1）。

4 GAC组织中Twist、Snail和KAI1表达之间的相互关系

Spearman等级相关分析显示，KAI1在GAC中免疫反应性与Twist的免疫反应性呈负相关关系；从表2可以看出，在GAC组织中KAI1与Snail的免疫反应性呈负相关；从表2可以看出，在GAC组织中Twist与Snai的免疫反应性l呈正相关。

5 多因素分析

将GAC组织分化程度（分为高分化组、中分化组与低分化组）、年龄（分为≥60岁组与＜60岁组）、肿瘤大小（分为＜4.0cm组、4.0cm≤D＜8.0cm组和≥8.0cm组）、肿瘤位置（分为胃窦组、贲门组和幽门组）、性别（分为男性组和女性组）、肿瘤类型（分为息肉组、溃疡组和浸润组、淋巴结转移（分为转移组与无转移组）、临床病理分期（分为Ⅰ+Ⅱ组和Ⅲ+Ⅳ组）、浸润深度（分为黏膜下组、浆膜下组、浆膜外组及累犯邻近组织组）、Snail免疫反应组（分为阳性组与阴性组）、Twist免疫反应组（分为阳性组与阴性组）、KAI1免疫反应组（分为阳性组与阴性组）等因素引入COX多因素模型进行分析，结果表明Twist和KAI1蛋白的免疫反应阳性和临床病理分期是影响GAC患者生存的独立预后因素（表3）。

6 生存分析

本组病例总的5年生存率为34.9%（91/261）。Kaplan-Meier生存分析显示Twist蛋白免疫反应阳性组患者的总体生存时间明显短于其阴性组患者，差异有统计学意义（图2A）；Snail蛋白免疫反应阳性组患者的总体生存时间明显低于其阴性组患者（图2B）；KAI1蛋白免疫反应阳性患者的总体生存时间明显高于其阴性组患者（图2C）。

图2　Twist、Snail或KAI1免疫反应性与GAC患者生存曲线。A，Twist；B，Snail；C，KAI1Fig.2 Immunoreactivity of Twist，Snail or KAI1 and survival curves of GAC patients.A，Twist；B，Snail；C，KAI1

表2　GAC中Twist、Snail和KAI1之间的相互关系Table 2 The relationship of Twist，Snali，and KAI1 immunoreactivity in GAC

表3　261例GAC患者的多因素分析Table 3 Multivariate survival analysis of 261 patients with GAC

讨 论

EMT赋予胚胎细胞潜在的运动能力，这对于胚胎器官的建立和上皮结构的演化至关重要［15］。后来在肿瘤的研究中也发现了EMT现象。GAC同所有的上皮性癌一样，在肿瘤细胞获得运动和侵袭能力的同时会发生EMT［16，17］，且EMT往往发生在癌细胞侵袭和转移的早期阶段。大量的研究表明转录因子Twist、Snail和ZEB等表达增高会诱导EMT。EMT过程与转移相关已经被普遍接受，但近年来有更多的研究发现 EMT过程也可以促进肿瘤的发生［15］。

Twist很长一段时间以来因为具有抗凋亡作用而被描述为癌基因，但是后来发现其在EMT过程起关键作用，从而促进癌细胞的转移［18，19］，而降低Twist的表达可以抑制癌细胞的转移能力［18］。本研究通过免疫组化ElivisionTMplus法研究261例GAC组织中Twist蛋白的免疫反应结果，发现其在GAC组织中的免疫反应阳性率为62.1%，明显高于其在对照组中免疫反应阳性率；Twsit蛋白的阳性率与GAC肿瘤细胞的浸润深度、淋巴转移与否及临床病理分期高低等之间均呈正相关关系。进一步的生存分析也显示Twist蛋白免疫反应阳性组患者总的生存时间明显低于其阴性组患者。上述结果说明Twist蛋白免疫反应的异常增高可能参与GAC的发展、浸润、转移及复发，其免疫反应阳性组预后不佳，与其他学者的研究结果相一致［5-6，20］。

Snail是EMT过程中另一个关键的转录因子，其结构中含有一个可以介导转录的N末端和特异性结合DNA（锌指结构）的C末端。研究表明，Snail在从果蝇到哺乳动物的中胚层和神经嵴的形态发生中起着关键作用。TGF-β可以通过Snail的激活而诱导EMT过程［21］。尽管癌细胞中Snail的表达增高可以促进EMT的形成，但其相关的信号通路和下游的分子机制不清楚［16］。本研究发现Snail蛋白在GAC组织中的免疫反应阳性率（60.1%）显著高于其在对照组中的免疫反应阳性率（5.0%）；进一步研究发现Snail蛋白的免疫反应阳性率与GAC肿瘤组织大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移与否及临床病理分期等之间均呈正相关关系。即Snail蛋白免疫反应异常增高可能参与了GAC的增殖、浸润及转移过程，生存分析也显示Snail蛋白免疫反应阳性组患者其生存时间短。上述结果与文献报道一致［15，22］。

肿瘤转移抑制因子KAI1属于4次跨膜糖蛋白超家族的重要成员之一。肿瘤细胞KAI1免疫反应缺失，因此丧失了KAI1对肿瘤细胞的运动、增殖及分化能力的抑制，从而导致肿瘤细胞的侵袭及转移［23］。本研究发现KAI1蛋白在对照组中的免疫反应阳性率为100%，而在GAC组中的免疫反应阳性率为38.3%，两组之间差异有统计学意义。随后的研究发现，KAI1蛋白的免疫反应阳性率与GAC肿瘤细胞浸润程度、分化程度、淋巴结转移与否及临床病理分期高低等均呈负相关关系。上述结果提示KAI1蛋白的免疫反应却是可能参与了GAC的发展、浸润及转移过程，且KAI1免疫反应阴性提示预后不良［11，24］。p53基因突变可以导致KAI1蛋白免疫反应下调或丧失，从而使其失去了抑制肿瘤细胞转移的能力。

本研究Spearman相关分析显示，在GAC中Twist和Snail的免疫反应性呈正相关关系。KAI1与Twist和Snail的免疫反应性均呈负相关关系。Twist和Snail均是EMT过程中的关键转录因子，它们的表达异常增高参与了GAC的发生［15］。并且随着它们的表达进一步增高，导致GAC细胞的形态由原来的圆形或立方形变成运动能力强的梭形，且细胞之间的黏附力和极性降低或丧失，细胞外基质重塑，造成上皮细胞向间充质细胞转化而引起GAC细胞的侵袭及转移。KAI1蛋白的表达降低或缺失则导致肿瘤细胞之间的黏附力进一步降低，最终造成肿瘤细胞更易于浸润及转移。COX多因素回归模型分析结果显示Twist和KAI1蛋白的阳性情况以及临床病理分期是影响GAC患者术后生存的独立预后因素。

综上所述，Twist和Snail的异常增高均可能会到导致GAC的发生，并且可能是EMT形成的基础；EMT和KAI1的免疫反应缺失直接参与了GAC细胞的浸润及转移，它们均意味着患者预后不良。因此，早期联合检测Twist、Snail和KAI1蛋白的免疫反应性可以作为评估GAC患者浸润、转移及预后的指标。

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Immunoreactivities of Twist，Snail and KAI1 in gastric adenocarcinoma and their clinicopathological significance

Lu Guoyu1，Wu Xiaofei1，Zhang Xiaohua1，Zhou Lei2*
（1Department of Emergency，2Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233003，China）

Objective To detect the immunoreactivity of the epithelial mesenchymal transition（EMT）related markers of Twist and Snail and that of the tumor metastasis suppressor KAI1 in primary gastric adenocarcinoma（GAC），and explore their association with the clinicopathological characteristics.Methods Immunoreactivity of Twist，Snail，and KAI1 protein was investigated by immunohistochemistry in 261 specimens of GAC tissues and 80 specimens of normal gastric tissues（as the control group）.Results The positive rate of immunoreactivity of Twist and Snail was significantly higher in GAC tissues than in control tissues；and that of KAI1 was significantly lower in GAC than in control tissues.The positive rate of immunoreactivity of Twist and Snail was significantly related to invasion，lymph node metastasis，and pTNM stage.There was a negative association between the immunoreactivity of KAI1 protein and differentiation grade，invasion，lymph node metastasis，and pTNM stage.Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival time of patients with positive Twist and Snail was significantly shorter than that of negative patients；and the survival time of patients with positive KAI1 was significantly longer than that of negative patients.Spearman analysis showed that there was a negative correlation between the positive immunoreactivity of KAI1 and that of Twist or Snail；and there was a positive correlation between the positive immunoreactivity of Twist and that of Snail.COX multivariate analysis showed that the positive immunoreactivity of Twist and KAI1 protein，and pTNM stage were independent prognostic factors of GAC patients.Conclusion The abnormal immunoreactivity of Twist，Snail，and KAI1 may be involved in the development，invasion，and metastasis of GAC.The combined detection of Twist，Snail，and KAI1 has an important role in predicting the progression and prognosis of GAC.

gastric neoplasm；Twist；Snail；KAI1；prognosis

R735.2

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2015-08-15 〔修回日期〕2016-02-25

安徽省高等学校自然科学研究项目（KJ2015B099by）；蚌埠医学院自然科学研究项目（byky1337）

陆国玉，男（1971年），汉族，副主任医师

（To whom correspondence should be addressed）：zhou_lei03@163.com