小肠腺癌组织中Notch1和P53免疫反应性增强

陈 玲吴 涛

（湖北省咸宁市通山县人民医院1病理科，2外科，咸宁 437600）



小肠腺癌组织中Notch1和P53免疫反应性增强

陈 玲1*吴 涛2

（湖北省咸宁市通山县人民医院1病理科，2外科，咸宁 437600）

目的 研究小肠腺癌中Notch1、Numb、P53和P63蛋白的免疫组织化学表达情况及意义。方法 采用免疫组织化学S-P法检测含有60例小肠腺癌（small intestinal adenocarcinoma，SIA）组织芯片中Notch1、Numb、P53和P63蛋白的表达情况，与9例正常小肠组织进行对照，并进行统计学分析。结果 在小肠腺癌组织中，Notch1免疫组织化学染色阳性率显著高于正常小肠组织，Notch1蛋白在小肠腺癌中的免疫组织化学表达与肿瘤TNM分期相关，而与年龄和性别不相关。P53在小肠腺癌组织中的免疫组织化学表达为41.7%，P53在正常小肠组织中无表达。Numb蛋白在小肠腺癌组织和正常小肠组织中阳性表达率分别为68.3%和77.8%，二者比较无统计学差异。Numb蛋白在小肠腺癌组织表达缺失率为31.7%。P63在小肠腺癌组织中表达率为5%，而在正常小肠组织中不表达。P53和Numb表达均与年龄、性别、TNM分期等临床病理参数不相关。相关分析显示，小肠腺癌中Numb与Notch1，P53与Numb、Notch1表达之间无相关性。结论 小肠腺癌组织中存在Notch1的过表达，且与小肠腺癌的进展相关，部分病例Numb蛋白表达缺失及P53突变，Numb-Notch1信号通路蛋白可能参与了小肠腺癌的发生机制。

小肠腺癌；Notch1；Numb；p53；p63

小肠恶性肿瘤是一种十分罕见的消化道恶性肿瘤，约占胃肠道恶性肿瘤的5%［1］，小肠恶性肿瘤中最为常见的是小肠腺癌（small intestinal adenocarcinoma，SIA），约占小肠肿瘤的30%～40%，发病率仅为大肠腺癌的1/50［2］。由于临床上缺乏典型症状和较高敏感性和特异性的影像学筛查方法，常常导致小肠腺癌诊断的延误。小肠腺癌预后较差，平均5年生存率为40%左右［3］。目前国内外对其临床特征、治疗及预后的研究较少。近年来小肠腺癌的发病率呈上升趋势，研究其发生的分子机制及信号转导机制对其诊治及预后的判断显得尤为重要。

目前，随着对肿瘤研究的不断深入，越来越多的研究者提出肿瘤形成的干细胞起源学说，认为在肿瘤中存在少量的干细胞，它们表达干细胞基因并有相似的信号转导通路，能够不断的增殖，促进癌细胞的产生，促进成瘤和肿瘤复发［4］，这些具有干细胞特征的细胞称为肿瘤干细胞。因此，对肿瘤干细胞的调控机制的研究对肿瘤治疗及预后判断具有重要意义。干细胞自我更新、多能性维持的信号转导途径，如Notch、SHH（Sonic hedgehog）和Wnt信号转导途径，在肿瘤形成中有确定的作用［5］。p53作为重要的抑癌基因之一，在肿瘤研究中广泛而深入，近年来证实p53家族还有p63、p73两种同源基因。p63基因与上皮源性肿瘤的发生发展关系较为密切，参与维持外胚层发育分化、上皮干细胞稳定性，在肿瘤中既可以促进肿瘤也可以抑制肿瘤［6］。

虽然已有大量研究表明Notch1、Numb、p53和p63与多种恶性肿瘤的侵袭和转移的发生有着密切的关系，但是它们在小肠腺癌中的表达及各蛋白之间的相关性，以及与临床病理特征的相关性研究尚未见报道。本文通过对60例小肠腺癌及9例正常小肠组织的组织芯片进行免疫组织化学检测，初步探讨Notch1、Numb、P53及P63蛋白在小肠腺癌发病机制中的作用。

材料和方法

1 标本来源

小肠腺癌组织芯片购自西安艾丽娜生物技术有限公司（SM208），其中小肠腺癌60例，正常小肠组织9例。组织芯片样点直径1.0mm，每例腺癌及正常组织均有三个组织点。60例小肠腺癌患者中男32例，女28例，年龄在35～74岁之间，淋巴结转移者8例。

2 试剂

抗Numb抗体购自 Abcam（ab139157），抗Notch1抗体购自CellSignalingTechnology（CST3608s），抗P53和抗P63抗体均购自福建迈新生物公司（MAB-0674；MAB-0365），SP法即用型免疫组织化学超敏试剂盒（KIT-9710）和DAB显色剂等均购自福建迈新生物技术有限公司。

3 免疫组织化学染色

按照S-P免疫组织化学试剂盒要求进行，抗P53、P63、Numb、Notch1抗体工作浓度分别为1：150；1：150；1：200；1：200。所有组织芯片均采用微波抗原热修复（切片浸入0.01mol/L，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中，15min），DAB显色，最后苏木素复染、脱水、透明、封片。用已知阳性小肠腺癌切片做阳性对照，PBS置换一抗作阴性对照。

4 结果判定与统计学分析

光镜下Notch1、Numb以细胞质内有棕黄色细颗粒为阳性信号，P53及P63以细胞核内棕黄色细颗粒为阳性信号。在200倍镜下随机选择5个不同视野，计算每张切片阳性细胞百分率（percentage of positive cell，PP），据切片中阳性细胞百分率将切片分4级：＜10%阳性细胞为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。另外据切片中阳性细胞染色强度（staining intensity，SI）记分，将阴性记为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。每例标本的最终评分为SI+PP，最高7分。按评分高低：＜1分为阴性（-），1～3分为弱阳性（1+），4～5分为阳性（2 +），6～7分为强阳性（3+）。

所有数据经SPSS18.0统计软件进行处理，计数资料率的比较用χ2检验，指标间的相关性分析应用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Notch1、Numb、P53及P63蛋白在小肠腺癌组织中的免疫反应性

S-P法免疫组织化学染色显示，Notch1蛋白在正常小肠腺上皮细胞中散在表达，主要位于细胞质和细胞核中，细胞膜几乎不着色（图1A）。在小肠腺癌组织中，Notch1免疫反应阳性产物位于瘤细胞的细胞质和细胞核中，但在强阳性表达病例中，瘤细胞胞膜上也可见阳性产物（图1B）。Numb蛋白呈胞质表达，正常小肠组织中Numb蛋白在隐窝中散在分布在胞质内（图1C）；在小肠腺癌组织中，Numb蛋白在胞质呈弱阳性（图1D）。正常小肠组织中P53及P63均无阳性表达（图1E，图1G）；小肠腺癌组织中P53及P63蛋白呈细胞核阳性表达（图1F，图1H）。60例小肠腺癌组织中，Notch1、Numb、P53阳性表达例数分别为46例（76.7%）、41例（68.3%）、25例（41.67%），P63仅3例表达阳性。小肠腺癌组织中，Notch1阳性率最高，达到76.7%，p63阳性率最低，仅5%；Numb蛋白的缺失率约31.7%。在正常小肠组织中，Numb阳性率最高，为77.8%（7/9），Notch1仅1例阳性，而P53及P63无表达。癌组织中Notch1及P53免疫组织化学表达显著高于正常小肠组织（P＜0.05）（表1）。

图1　Notch1，Numb，P53和P63蛋白在正常小肠粘膜及小肠腺癌组织中的免疫组织化学表达。A，正常小肠组织中Notch1免疫反应性；B，SIAs组织芯片中Notch1免疫反应性；C，正常小肠组织隐窝中Numb免疫反应性；D，SIAs组织芯片中Numb免疫反应性；E，正常小肠组织中P53免疫反应性；F，SIAs组织芯片中P53免疫反应性；G，正常小肠组织中P63免疫反应性；H，SIAs组织芯片中P63免疫反应性；比例尺，100μmFig.1 Notch1，Numb，P53 and P63 expression in normal small intestinal tissue and SIA tissue.A，Notch1-Immunoreactivity in normal small intestinal tissue；B，Notch1-Immunoreactivity in SIA tissue microarray；C，Numb-immunoreactivity in normal small intestinal crypts；D，Numb-immunoreactivity in SIA tissue microarray；E，P53-immunoreactivity in normal small intestine tissue；F，P53-immunoreactivity in SIA tissue microarray；G，P63-immunoreactivity in normal small intestinal tissue；H，P63-immunoreactivity in SIA tissue microarray；scale bar，100μm

表1　Notch1、Numb、P53和P63蛋白在正常小肠组织及小肠腺癌组织中的免疫组织化学表达Table 1 The immunohistochemical expression of Notch1，Numb，P53 and P63 in SIA tissue

2 Notch1免疫组织化学阳性表达率在TNM分期III+IV期显著高于I+II期

对Notch1、Numb、P53及P63在小肠腺癌中的免疫反应性与其临床病理特征之间的关系分析显示，Notch1蛋白在TNM分期III-IV期组的阳性率高于TNM分期I+II期组（P=0.025；表2）。Spearman相关性分析结果显示，Notch1蛋白的阳性率与小肠腺癌TNM分期相关（表2），而与患者性别、年龄、淋巴结转移无显著相关性（表2）；P63在小肠腺癌的3例阳性表达均出现在TNM分期III-IV期中。Numb和P53与小肠腺癌患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移无显著相关性（表2）。

表2　Notch1、Numb、P53、P63免疫反应性与小肠腺癌临床病理特征的关系Table 2 The relationships of immunoreactivity of Notch1，Numb，P53 and P63 to clinicopathological characteristics of SIA.

3 小肠腺癌组织中Notch1、Numb及p53免疫反应性之间无相关性

对小肠腺癌组织中Notch1、Numb及P53免疫反应性之间的相关性分析显示，Notch1与Numb免疫反应性之间和P53与Notch1、Numb免疫反应性之间无显著相关性（P＞0.05）。

表3　小肠腺癌组织中Notch1与Numb免疫反应性之间的关系Table 3 The relationship between Notch1-and Numb-immunoreactivity in SIA tissue

表4　小肠腺癌中　P53免疫反应性与Numb和Notch1免疫反应性之间的关系Table 4 The relationship of P53-immunoreactivity with Notch1-and Numb-immunoreactivity in SIA.

讨 论

Notch信号通路作为一条经典的干细胞信号通路，不仅影响细胞的分化、增殖、凋亡、粘附等活动，而且在胚胎发育、肿瘤形成等生理病理过程中都起着极其重要的作用。Notch信号通路的异常存在于很多肿瘤的发生发展过程中：Notch信号在胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌中作为促癌基因，表达上调［7-10］；同时Notch信号在小细胞肺癌、肝癌、前列腺癌、皮肤癌、食管癌中作为抑癌基因表达下调［11-13］；而Notch信号在子宫颈癌中有促癌基因，抑癌基因的双重作用［11］。一项针对结肠癌中Notch1蛋白表达的研究显示，Notch1蛋白在正常组织中不表达，而在结肠癌中阳性表达，且其表达强度与恶性程度和病理分级相关，因此在结肠癌中，Notch1蛋白作为促癌因子发挥作用［12］。关于Notch信号在小肠腺癌的研究还未见报道。本研究证实在小肠腺癌组织中，Notch1蛋白的表达水平显著高于正常小肠粘膜，并且与腺癌的TNM分期相关，提示Notch1蛋白参与小肠腺癌的发生发展，其过表达可能与肿瘤的恶性进展有关。在TNM分期高的小肠腺癌组织中，Notch1蛋白表达水平升高，可能与其上调基质金属蛋白酶-9（MMP-9）及血管内皮生长因子（VEGF）导致的侵袭浸润增强有关［14］。

Numb蛋白是一种不对称分布的蛋白，也是一种进化上保守的蛋白，在细胞命运决定中起着重要的作用［15，16］。有研究表明：Numb是Notch信号的负性调控因子，当其表达降低时，可能会抑制P53活性［17］。通过基因操作手段沉默Numb，敲除该基因，或使其发生突变均会影响WNT-Notch信号转导通路，最终导致肿瘤的发生［18］。Numb蛋白在肠隐窝广泛表达，通过抑制Notch信号调节肠上皮细胞与杯状细胞的转化［19］。在本研究中，Numb蛋白在小肠腺癌的阳性表达率为68.3%，缺失率约31.7%，Numb的表达与年龄、性别、TNM分期等临床病理参数不相关。有文献报道，21%乳腺癌病例Numb表达下调或缺失，且Numb表达缺失或低表达的病例Notch1表达水平高［20］。但在我们的研究中，Notch1与Numb表达亦无统计学相关性。究其原因，小肠腺癌组织中Numb阳性表达率虽低于正常小肠粘膜组织，但无显著差异，可能是由于我们的小肠腺癌和正常对照小肠组织样本量较少。此外，Numb在多种癌组织中高表达，如子宫内膜癌、胰腺导管腺癌组织，其表达显著高于正常对照组织［21，22］，肝癌组织中Numb蛋白高表达与预后差相关［23］。

p53是一种大多数肿瘤中广泛存在突变的抑癌基因。目前已有研究指出突变型P53蛋白阳性表达率约为40%-75%，分化程度低的小肠腺癌表达较高，并与腺癌恶性程度相关［27-29］。本实验中，P53在小肠腺癌组织中阳性率为41.7%（25/60），而在9例正常小肠组织中p53不表达，提示p53的突变可能参与小肠腺癌的发生。但P53的表达与年龄、性别、TNM分期等临床病理参数不相关。Lefort等［25］报道在皮肤癌中，Notch1是P53的靶基因，通过下调Rho的效应基因ROCK1/2和MRCK alpha发挥抑癌基因的作用。我们随后分析了P53与Notch1、Numb表达相关性，结果发现小肠腺癌组织中P53与Notch1、Numb表达之间无相关性，提示这几个基因在小肠腺癌中相互调节关系或相关程度可能与其他肿瘤不同。

p63基因是p53的同源基因，与上皮源性肿瘤的发生发展关系较为密切，参与维持外胚层发育分化、上皮干细胞稳定性，在肿瘤中既可以促进肿瘤也可以抑制肿瘤［6］。研究发现，P53、P63均能激活P53相关靶基因，深入研究发现，它们都具有核心DNA结合区、C-寡聚体化区、N端转录激活区，并能促使p53相关靶基因激活，引发细胞凋亡［24］。并且P53、P63蛋白均被报道与Notch信号通路相关，P63能够特异性激活Notch信号通路的两个配体：Jagged1基因和Jagged2基因［26］，从而参与到Notch信号通路中。关于p63基因在腺癌中的表达情况鲜有报道（仅在肺腺癌中有少量报道），有研究统计其在肺腺癌中表达水平约为为0%～20%，而在肺鳞癌中表达水平大多是大于50%［30］。本研究结果显示，小肠腺癌中P63的表达与肺腺癌中一致，60例小肠腺癌中阳性表达率5%，表明P63蛋白在小肠腺癌中表达水平较低，并且仅仅存在于TNM分期III-IV期的病例中。

本研究结果提示Notch1的过表达与小肠腺癌的发生进展相关，部分病例Numb蛋白表达缺失及p53突变，Numb-Notch1信号通路蛋白可能参与了小肠腺癌的发生，Notch1可作为小肠腺癌治疗的靶点。

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Elevation of Notch1-and P53-immunoreactivity in small intestinal adenocarcinoma

Chen Ling1*，Wu Tao2
（1Department of Pathology，2Department of Surgery，The People's Hospital of Tongshan，Xianning 437600，China）

Objective To investigate the expression of Notch1，Numb，p53 and p63 proteins and their clinicopathological significance in small intestinal adenocarcinoma（SIA）.Methods Immunohistochemistry for Notch1，Numb，p53 and p63 was performed using tissue microarrays with 60 cases of SIA and 9 samples of normal small intestinal mucosa.Results Notch1 positive expression was higher in SIA than in normal small intestine tissue.The positive expression of Notch1 was significantly associated with TNM stage. P53 expression was positive in 41.7%of SIA，but negative in the normal small intestine tissue..Numb was positive in 68.3%of SIA and 77.8%of normal small intestine tissue，with no significant difference between the two groups.Numb protein loss was observed in 31.7%of SIA.P63 expression was present in 5%of SIA but absent in any case of normal mucosa.P53 and Numb expressions were not associated with age，gender，lymphatic metastasis or TNM stage.There was no significant correlation between Numb and Notch1，P53 and Notch1/Numb in SIA.Conclusion Notch1 over-expression，Numb protein loss and p53 mutation may be involved in the pathogenesis of SIA.

Small intestinal adenocarcinoma；Notch1；Numb；p53；p63

R365

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.

2016-01-18 〔修回日期〕2016-03-18

陈玲，女（1974年），汉族，主治医师

（To whom correspondence should be addressed）：630394371@qq.com