过表达细胞周期蛋白的Dl对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的作用*

赵阿龙，叶 明，张翠萍，马 奎，周云超，谭志军，付小兵

过表达细胞周期蛋白的Dl对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的作用*

赵阿龙1，2，叶 明3△，张翠萍2△，马 奎2，周云超2，谭志军1，2，付小兵2

（1.天津医科大学 ，天津300070；2.解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室 ，3.解放军总医院第一附属医院肿瘤一科 ，北京100048）

目的 :观察过表达细胞周期蛋白D1（CCND1）对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的调控作用。方法 :构建携带CCND1基因的真核表达载体PEGFP-N1-CCND1，将PEGFP-N1-CCND1转染人成熟表皮细胞，5 d后 ，倒置显微镜下观察细胞形态；细胞计数法观察细胞的增殖情况；免疫荧光法检测表皮干细胞标志抗原β1整合素和成熟表皮细胞标志抗原CK10的表达变化。结果 :转染PEGFP-N1-CCND1后 ，细胞体积变小，核浆比例增大 ；细胞增殖较快 ，细胞数量比对照组增加了4倍（P＜0.01）；表型检测结果显示 ，转染PEGFP-N1-CCND1组，表达干细胞标志性蛋白β1整合素表达阳性 ，成熟表皮细胞标志性蛋白CK10表达阴性 ，而转染空载体组则相反。结论 :CCND1过表达能够诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞。

CCND1；去分化 ；表皮干细胞 ；成熟表皮细胞

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.019

表皮干细胞是皮肤创面修复和组织工程领域重要的种子细胞。但这些干细胞在皮肤组织中含量很少，尤其大面积皮肤缺损的病人，表皮干细胞数量进一步减少，这大大限制了它的临床应用。成熟表皮细胞去分化可以提供大量的表皮干细胞，据报道，Wnt/β-catenin通路在成熟表皮细胞去分化过程中起着重要的调控作用，细胞周期蛋白D1（CCND1）是β-catenin的下游靶基因［1］，而CCND1是否参与表皮细胞的去分化目前还不清楚。本研究构建了携带CCND1基因的真核表达载体PEGFP-N1-CCND1，并将PEGFP-N1-CCND1转染人成熟表皮细胞，观察细胞的形态、表型和增殖功能。

1 材料和方法

1.1 材料

Epilife培养基、0.025%胰蛋白酶和胰蛋白酶终止剂（美国Gibco公司），兔抗人整合素β1抗体和兔抗人角蛋白ck10，Lipofectamine（美国Invitrogen公司），取自包皮过长病人术后的正常成人包皮，并征得当事人同意，签署知情同意书。

1.2 PEGFP-N1-CCND1载体的构建鉴定

由上海比昂生物医药科技有限公司完成。提取人脑组织mRNA，逆转录制备 cDNA。根据 CCND1（基因号: BC014078）的序列，应用primer 5设计引物CCND1-F（Bgl2）: GAAGATCTATGGAACACCAGCTCCTGTG；CCND1-R（Kpn1）: GGGGTACCGTGATGTCCACGTCCCGCAC然后PCR扩增CCND1目的序列，产物用Bgl2和Kpn1核酸内切酶双酶切后纯化处理，连接入同样双酶切处理并去磷酸化PEGFP-N1载体中，构建过表达穿梭质粒PEGFP-N1-CCND1。随后转入至感受态细菌DH5a，涂布含Amp的LB琼脂平板，37℃过夜培养。选取平板上1-9号菌落进行PCR（引物:CCND1-F/CCND1-R）。挑出阳性基因纯化回收，并取出3μl用Bgl2/Kpn1双切后与3μl PEGFP-N1一起跑胶，并对酶切鉴定正确的克隆送公司做测序［2］。

1.3 人表皮细胞的培养及转染

按文献所述的方法［3，4］获取成熟表皮细胞和表皮干细胞。按LipofectamineTM 2000试剂说明，将4μg的PEGFP-N1加至250μl的OPTI-MEM培基中，混匀。将10μl的LipofectamineTM 2000加至另外250μl的OPTI-MEM中，轻轻混匀，室温静置5 min。将PEGFP-N1-CCND1悬液和LipofectamineTM 2000悬液混合，总体积500μl，轻轻混匀，室温静置20 min。将PEGFP-N1-CCND1和LipofectamineTM 2000混合液加至6孔板的孔内，前后左右晃动孔板混匀，置于培养箱中培养6 h后，吸去转染液，每孔中加入3 ml Epilife培养基继续培养2 d。待细胞生长状态好转，加入含有浓度为200mg/ml G418 的Epilife培养基置于培养箱中培养3～6 d。期间2 d换一次含有G418的培养基，镜下观察待有细胞团块状生长，即为转染成功的细胞 ，随机倒掉培养基，加入4 ml Epilife完全培养基继续培养5 d。随后用0.025%胰蛋白酶将团块状生长细胞定点消化下来，传代培养，并把此组设为对照组。同时把空载体也按上述步骤转染成熟表皮细胞，设为空载体组。把表皮干细胞单独培养，设为表皮干细胞组。将各组细胞用0.025%的胰蛋白酶消化成单细胞悬液 ，胰蛋白酶终止液终止消化并离心，Epilife培养基重悬，以5×105cells/well密度接种于25 cm2培养瓶中，放于37℃培养箱中培养，5 d取出细胞 ，消化成单细胞悬液计数。

1.4 质粒转染成熟表皮细胞效率的测定

荧光显微镜下分辨率调到400倍，随机选择10个视野，观察每个视野细胞总数和转染的细胞数，以百分率表示每个视野成熟表皮细胞转染效率。

1.5 免疫细胞荧光检测

分别将PEGFP-N1-CCND1转染表皮细胞，空载体转染表皮细胞和表皮干细胞分别接种于激光共聚焦专用培养皿中，培养48 h。吸走培养液，多聚甲醛固定15min。羊抗血清封闭1 h，分别加入羊抗人整合素β1抗体和角蛋白CK10抗体，冰箱4℃孵育过夜［5］。第2天从冰箱中取出 ，加入二抗PE孵育2 h，用Dapi染核［6］。随后把各组细胞拿到共聚焦显微镜下观看发光情况。

1.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析及 q检验。

2 结果

2.1 平板挑菌与酶切鉴定

选取的1-9号菌落进行PCR，结果1，2，3，7，8号为阳性（图1A）。通过CCND1（基因号BC014078）的序列查出CCDN1序列为888 bp，根据PEGFP-N1-CCND1用双切酶Bgl2/Kpn1双切后和PEGFP-N1（图1C）的结果显示:PEGFP-N1-CCND1双切后产生约900 bp的CCND1片段和较大的PEGFP-N1片段（图1B），同时测序鉴定结果也显示序列为888 bp，与CCND1（基因号BC014078）的序列一致。

Fig.1 Vector synthesis and IdentificationA:For the purpose gene by bacteria breeding；B:Enzyme digestion analysisof PEGFP-N1-CCND1；C:Plasmid structure for vector construction

2.2 细胞增殖情况

将培养5 d后的实验组，空载体组和表皮干细胞组细胞从培养箱中取出，消化成单细胞悬液计数。可以看出PEGFPN1-CCND1转染的细胞数量是空载体转染细胞数量的4倍，但与表皮干细胞数量相当（P＜0.01，表1）。

Tab.1 Number of the cells 5 days later（±s）

Tab.1 Number of the cells 5 days later（±s）

**P＜0.01 vs control group

Group　Cells（×105）Control　6±1 Experimental　24±2**Epidermal stem cells　25±2**

2.3 CCND1对成熟表皮细胞形态的影响

表皮干细胞培养6代后细胞开始出现老化迹象，胞体变宽大扁平、胞核变小、核浆比例减小、代谢缓慢且生长停滞；而PEGFP-N1-CCND1转染的细胞胞核变大，胞体形态缩小，核浆比例增大，趋近于表皮干细胞的形态；空载体转染组的细胞则没有明显变化。说明成熟表皮细胞转染PEGFP-N1-CCND1后，形态类似于表皮干细胞（图2）。

Fig.2 Morphological characteristics of epidermal cells in the four groups（×200）A:Non transfection group；B:Empty vector transfection group；C:CCND1 transfection group；D:Positive control group；CCND1:Cyclin D1

2.3 质粒转染成熟表皮细胞的效率

通过倒置相差荧光显微镜计数表明，PEGFP-N1-CCND1 和PEGFP-N1质粒转染成熟表皮细胞后 ，其转染效率为30.23%±4.11%和30.15%±4.23%，差异有统计学意义（P ＜0.01）。

2.4 细胞标志蛋白β1和CK10的表达情况

激光共聚焦显微镜下，PEGFP-N1-CCND1转染细胞表皮干细胞标志蛋白β1整合素表达阳性，而作为成熟表皮细胞标志蛋白CK10表达阴性，这与表皮干细胞的表型类似。空载体转染组却与上两组相反，β1的表达阴性，CK10表达阳性。说明成熟表皮细胞转染PEGFP-N1-CCND后，具有了表皮干细胞的表型特征（图3，见彩图页Ⅴ）。

3 讨论

长期以来，人们一直认为人和哺乳动物细胞在发生终末分化后便不可逆转，新近的研究显示终末分化的细胞也存在去分化的潜能。研究表明，Oct4、Sox2、KLf4、Myc等几个因子可以重新把体细胞编程为iPSCs细胞［7］。Edel报道了CCND1的高表达也可以提高iPSCs的重编程的效率［8］。报道指出抑制CCND1的表达是细胞分化的标志［9］。本实验尝试通过调高CCDN1的表达来促进细胞的去分化以探讨其可行性。

前期研究结果发现，成熟表皮细胞发生去分化过程中CCND1的表达显著增高，据此推测基因CCND1与表皮细胞的去分化有关联。因此，本研究中调高了成熟表皮细胞中的CCND1的表达水平，结果发现，PEGFP-N1-CCND1诱导后的成熟表皮细胞形态和增殖速度都发生类似于表皮干细胞的变化，并且具有了表皮干细胞的表型特征。这些结果表明，CCND1可以诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞。这提供了一个获取大量表皮干细胞有效的方法，从而更好的开展创面修复和皮肤的组织工程。但是，本研究还将更深入探索CCND1诱导后的表皮细胞在动物体内是否也具有类似表皮干细胞促进创面愈合的作用。

［1］Zhang C，Chen P，FeiY，et al.Wnt/beta-catenin signaling is critical for dedifferentiation of aged epidermal cells in vivo and in vitro［J］.Aging Cell，2012，11（1）:14-23.

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［6］王 静 ，钟 华，赵 慧，等.STIM2、TRPC3在人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流和NO生成中的作用［J］.中国应用生理学杂志，2014，30（4）:327-332.

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cyclin D1；dedifferentiation；epidermal stem cells；mature skin cells

R34

A

1000-6834（2016）03-263-03

国家973计划资助项目（2012CB518105）；国家自然科学基金面上项目（81571905，81121004，81230041，81171798）

2015-11-11

2016-02-23

Tel:010-66867391，010-66848690；E-mail:yeming304 @163.com），zcp666666@sohu.com