瑞舒伐他汀对颈动脉粥样硬化患者单个核细胞CCR2表达的影响及机制*

杜瑞雪，叶 平△，颜光涛，邓子辉，梁文涛，郭子宽，张红红，耿 淼

瑞舒伐他汀对颈动脉粥样硬化患者单个核细胞CCR2表达的影响及机制*

杜瑞雪1，叶 平1△，颜光涛2，邓子辉2，梁文涛3，郭子宽5，张红红4，耿 淼4

（1.解放军总医院南楼心内科 ，2.基础医学研究所 ，3.普通外科研究所 ，4.老年医学研究所 ，北京100853；5.军事医学科学院放射与免疫研究所，北京100850）

目的:探讨瑞舒伐他汀对颈动脉粥样硬化患者单个核细胞CC类趋化因子受体2（CCR2）表达的影响及上游机制。方法:选择颈动脉粥样硬化患者20例。予瑞舒伐他汀5～20mg/d治疗。在基线、3月时采集血标本，测定单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及血脂水平；分离单个核细胞，流式细胞学检测单个核细胞上的CCR2表达；荧光定量逆转录PCR法检测CCR2、过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR）βmRNA的表达；Western印迹法检测PPARβ蛋白的表达。结果:瑞舒伐他汀治疗3个月后，患者低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平明显降低（P＜0.01），MCP-1及单个核细胞CCR2表达显著下降（P＜0.05），PPARβmRNA及蛋白表达均较前增加（P＜0.05）。结论:瑞舒伐他汀可能通过PPARβ途径降低MCP-1，抑制单个核细胞CCR2的表达。

瑞舒伐他汀；动脉粥样硬化；CC类趋化因子受体2；过氧化物酶体增生物激活受体β

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.003

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病。他汀类药物可降低缺血性心脑血管疾病的发生率和死亡率［1］，其机制除主要与降低血浆胆固醇水平有关外 ，还可能涉及到抗炎作用［2-4］，其中多条炎症信号通路参与其中。单核细胞趋化蛋白-1 （monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）是诱导AS慢性炎症发生的主要趋化因子，对单个核细胞具有很强的趋化活性。这种趋化作用主要靠MCP-1与单个核细胞上的CC类趋化因子受体（C-C chemokine receptor，CCR2）结合实现。然而，目前他汀作用于CCR2的研究多来源于动物实验和体外细胞培养［5，6］，在体研究还很少，且机制不清。本研究初步探讨了瑞舒伐他汀对颈动脉粥样硬化患者单个核细胞CCR2的影响以及和过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）β途径之间的关系，以期为防治AS提供新的思路和治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择在解放军总医院门诊及周围社区医院就诊的颈动脉粥样硬化患者共20例，男性17例，女性3例。所有患者均符合以下入选标准:年龄40～70岁；低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoproteincholesterol，LDL-C）2.0～6.5 mmol/L；甘油三酯≤4.0mmol/L；超声证实有明确的颈动脉粥样硬化斑块且含有脂核；既往从未使用过他汀类药物；随访期间能保持低胆固醇饮食（遵照中国成人血脂异常防治指南中有关低胆固醇的饮食的要求）。排除标准:严重肝肾疾病、既往有脑出血病史、继发性血脂代谢异常或有家族性高胆固醇血症、恶性肿瘤、有急、慢性炎症性疾病或处于免疫缺陷状态者、随访期内必须应用其他降脂药等。该研究经解放军总医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 治疗用药及随访

入选患者予瑞舒伐他汀10 mg/d作为起始剂量，4周后测量空腹血脂水平，并监测肝肾功能、肌酸激酶。如果LDL-C≥2.0 mmol/l或HDL-C＜1.0 mmol/l，瑞舒伐他汀的剂量将增至20mg/d，如TC≤3.0mmol/l，瑞舒伐他汀则减量为5mg/d。治疗3月后随访结束。所有患者在基线、12周时采集血标本用于流式细胞学检测、单个核细胞制备及血浆分离，并化验血脂、肝肾功能、肌酸激酶、血常规。

1.3 主要试剂

Ficoll-Paque PLUS；Human MCP-1 ELISA试剂盒；鼠来源单克隆CCR2抗体（Alexa Fluor 647）；鼠来源单克隆CD14抗体（FITC）；鼠来源单克隆CD3抗体（PE-Cy5）；以上抗体鼠来源同型对照；总RNA提取试剂TRIzol；RT试剂盒；核蛋白提取试剂盒；鼠来源单克隆PPARβ抗体。

1.4 血浆单核细胞趋化蛋白-1浓度测定

取血浆0.5 ml，采用ELISA双抗体夹心法按试剂盒说明书测定血（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）含量，方法按操作说明进行。

1.5 密度梯度离心法制备单个核细胞

将l0ml抗凝血2 000 r/min离心10min，取上层血浆，存放于-80℃冰箱，备用。下层全血细胞与PBS液1∶2混匀后，缓慢加入到人单个核细胞分离液Ficoll-Paque PLUS的液面上，细胞悬液与单个核细胞分离液比例为4∶3，2 000 r/min离心20 min。收集单个核细胞层至新的离心管，加入其体积5倍的PBS液，2 000 r/min离心5min，弃上清液。加入PBS液重悬细胞，重复上述过程，即得单个核细胞。用1.5ml PBS液重悬细胞，细胞计数后，其中0.5ml细胞悬液用于提取RNA，剩余的1ml细胞悬液用于提取核蛋白。

1.6 流式细胞学测定单个核细胞表面CCR2的表达

在5 ml流式管中避光加入抗CD3、抗CD14、及抗CCR2各20μl，对照管中加入以上抗体鼠来源的同型对照。加200μl全血，室温避光孵育15min；加入1×溶血素（10倍稀释）2 ml，室温避光孵育10 min；离心1 500 r/min 5min，之后去上清；加入2ml PBS液，离心1 500 r/min 5min，去上清，重复上述步骤一次；加入500μl PBS，BD流式细胞仪检测CD3+/ CCR2+，CD14+/CCR2+阳性细胞数，结果以上述免疫标志占CD3+，CD14+阳性细胞数的百分比表示。

1.7 荧光定量RT-PCR测定单个核细胞CCR2、PPARβ的mRNA表达

TRIzol RNA提取试剂盒提取单个核细胞总RNA；使用如下体系体外逆转录合成cDNA:42℃30 min，99℃5min，5℃5min。采用荧光定量RT-PCR测定CCR2、PPARβmRNA的表达，引物由上海生工公司合成。其中CCR2引物 （扩增片段长度99 bp）上游:5'-CCATCATCTATGCCTTCGTTG-3'，下游:5'-GGACCTCCACACACTGGTTT-3'；PPARβ引物（扩增片段长度105 bp）上游:5'-TCAGAGCACAGAGGTAGG AGAA-3'，下游:5'-CACTTCCACCCAGAGTCACA-3'。以β-actin为内参基因。反应条件为:95℃预变性2 min；扩增；95℃变性20 s，59℃退火25 s，72℃延伸30 s，共45个循环。基因的表达量用2-△△Ct法进行计算。

1.8 Western blot测定单个核细胞PPARβ的蛋白表达

按照核蛋白提取试剂盒说明冰上操作提取单个核细胞核蛋白，BSA法进行蛋白含量的测定。以30 μg蛋白/泳道上样，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入PPARβ抗体，4℃孵育过夜；洗涤后再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗孵育。应用ECL显色试剂盒显色，暗室下显像及拍片。以Histone作为内参照，凝胶分析成像软件分析结果。实验中所用抗体浓度:鼠来源单克隆PPAR-β抗体浓度1∶500；鼠来源单克隆Histone抗体浓度1∶1 000；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG浓度1∶3 000。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 病人一般临床资料

20例病人全部完成随访。瑞舒伐他汀的最终服用剂量:5mg者7例；10mg者7例；15～20mg者6例（表1）。

Tab.1 General data of patients（n =20）

2.2 瑞舒伐他汀对血脂及血浆MCP-1的影响

瑞舒伐他汀治疗3个月后，患者的LDL-C、TC、TG水平较基线均降低（P＜0.05），尤以LDL-C降低明显，HDL-C水平有一定程度增加但与基线比较，差异无统计学意义。瑞舒伐他汀治疗后，MCP-1水平降至51.27（40.46，69.23）pg/ml，与基线相比，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.3 荧光定量RT-PCR检测瑞舒伐他汀对单个核细胞CCR2mRNA及PPARβmRNA表达的影响

荧光定量RT-PCR显示，瑞舒伐他汀治疗3月后，单个核细胞CCR2 mRNA从基线1.12（0.81，2.23）降至1.08（0.70，1.21）。PPARβmRNA表达则明显增加，从1.28（0.64，1.48）升至2.60（1.50，3.81）（P＜0.05）。

2.4 流式细胞学检测瑞舒伐他汀对单个核细胞CCR2表达的影响

应用细胞表面特异性抗原CD3标记T淋巴细胞，CD14标记单核细胞，流式细胞学检测结果显示，瑞舒伐他汀对两种细胞CCR2表达均表现出明显的抑制作用。其中CCR2阳性淋巴细胞数:基线为8.42%（6.27%，10.68%），3月为1.51%（1.02%，2.32%）（P＜0.05，图1）。CCR2阳性单核细胞数:基线为95.88%（91.03%，98.17%），3月为87.52%（84.92%，89.92%）（P＜0.05，图2）。

Tab.1 Effectof rosuvastatin on expression of CCR2 in lymphocyte cells

Tab.2 Effect of rosuvastatin on expression of CCR2　in macrophage cellsCCR2:C-C chemokine receptor 2

2.6 Western blot检测瑞舒伐他汀对单个核细胞PPARβ蛋白表达的影响

瑞舒伐他汀对单个核细胞PPARβ核内活化蛋白有上调作用，治疗前后目的蛋白与内参蛋白的比值分别为（1.64±0.80）、（3.89±2.69），差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

Tab.3 Effectof rosuvastatin on expression of PPARβPPARβ:Peroxisome proliferator-activated receptorβ

Tab.2 Effectof rosuvastatin on lipid profile and MCP-1（n=20）

3 讨论

本研究发现，瑞舒伐他汀治疗后，不但血浆中MCP-1水平显著下降，而且单个核细胞表面CCR2的表达明显减少，提示瑞舒伐他汀良好的抗单个核细胞趋化作用。

既往针对他汀作用于MCP-1的研究较多。近年来，作为MCP-1的受体，CCR2在AS中的作用逐渐被人们重视。研究发现，单核细胞迁移到动脉壁很大程度上受活化的CCR2的调节，而选择性CCR2拮抗剂（GSK1344386B）则显著抑制单核巨噬细胞浸润动脉粥样硬化斑块［7］。进一步研究显示 ，在ApoE-/-及LDLr-/-小鼠模型中，CCR2缺失不但导致巨噬细胞浸润显著减少，而且使AS斑块明显缩小，提示CCR2在促进斑块发生发展中起重要作用［8-10］。

然而，目前观察他汀类药物对CCR2影响的研究并不多，且主要以培养的单核细胞或单核细胞系为研究对象，在体研究很少。Han KH等［11］曾入选21例胆固醇正常的健康男性志愿者，予辛伐他汀（20mg/d）治疗2周后发现，外周血单核细胞表面CCR2的表达下降。本研究拓展了Han的研究成果。入组患者有明确的颈动脉粥样硬化脂质斑块，同时合并吸烟、2型糖尿病、高血压、基线LDL-C水平不达标等多种冠心病危险因素，部分患者尚有脑梗死病史，属于未来心血管事件的高危人群，他汀治疗对其具有更为重要的意义。研究结果显示，伴随着LDL-C从3.30 mmol/L降至1.80 mmol/L，不但单核细胞上的CCR2表达明显下降，T淋巴细胞表面CCR2也受到显著抑制，提示瑞舒伐他汀对这部分心血管事件高危人群从MCP-1和CCR2两方面减少单个核细胞的趋化，可能在防止脂核增大、控制斑块内炎症、稳定斑块等方面起有益作用。

MCP-1/CCR2的上游通路涉及到多种途径。基础研究初步显示，PPARβ，作为过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）其中的一个亚型，可能是连接他汀和下游MCP-1/CCR2等炎症因子的纽带之一［12-14］。

在培养的人肺动脉平滑肌细胞和鼠小胶质神经细胞中，PPARβ活性增加能减少TNF诱导的MCP-1表达或放射损伤导致的MCP-1增加［15，16］。在高脂饲料喂养的Ldlr-/-小鼠中，PPARβ激动剂GW1516能显著减少斑块内巨噬细胞的浸润和炎症反应，减少主动脉斑块内脂质渗入，增强胶原蛋白组织沉积，延缓斑块进展［17］。提示 PPARβ通过抑制下游MCP-1/CCR2发挥抗AS作用。

然而，他汀是否影响PPARβ尚未可知。有学者发现，在培养的人脐静脉内皮细胞中，他汀可增加PPARβ的表达［18］。既往本研究组在培养的小鼠心肌细胞及老年大鼠模型中也发现，他汀通过上调PPARβ，发挥抗心肌肥大、抑制心脏衰老、保护肾脏的作用。然而，他汀对人体环境下参与AS的炎性细胞如何作用尚不明确。

本研究显示，应用平均11mg瑞舒伐他汀治疗后，在基因转录水平，瑞舒伐他汀上调单个核细胞PPARβ的表达；提取核蛋白进行Western blot亦显示，瑞舒伐他汀对PPARβ的蛋白活性同样具有上调作用。据此，我们推测，瑞舒伐他汀除显著降脂外，还可能通过PPARβ上游通路在一定程度上抑制MCP-1/CCR2水平，起到抗炎作用。这为完善他汀类药物的抗动脉粥样硬化作用提供了一定理论依据，为将来寻找新的药靶提供了新的思路。同时，由于人体条件的限制，PPARβ上调是否与MCP-1/ CCR2降低直接有关尚需进一步研究证明。

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The effect of rosuvastatin therapy on CCR2 expression in mononuclear cells and its upstream pathway

【ABSTRACT】Objective:To investigate the effectof rosuvastatin therapy on C-C chemokine receptor（CCR2）expression inmononuclear cells in patientswith carotid atherosclerosis and explore the possible upstream mechanism.Methods:Twenty patientswithout previous statin treatmentwere enrolled.Rosuvastatin were given 5 to 20 mg/day for 3 months.At baseline and 12 weeks，lipid profile and plasmamonocyte chemotactic protein-1（MCP-1）levelswere examined.ThemRNA and protein expressions of CCR2 in themononuclear cellsweremeasured with RT-PCR and flow cytometry，respectively.ThemRNA and protein expression of peroxidase proliferator-activated receptor（PPARβ）were detectedwith RT-PCR and Western blot，respectively.Results:After 3-months rosuvastatin treatment，the patients'low-density lipoprotein cholesterol（LDL-C）levels decreased significantly（P＜0.01）.Comparedwith baseline，themRNA and protein expressions of CCR2 in the mononuclear cells showed significantly decrease，aswellasplasmaMCP-1 levels（P＜0.05）.BothmRNA and protein expressionsof PPARβ in themononuclear cells increased（P＜0.05）.Conclusion:Rosuvastatinmay attenuateMCP-1/CCR2 through PPARβupstream pathway.

rosuvastatin； atherosclerosis； CCR2； PPARβ

R453.9

A

1000-6834（2016）03-202-05

国家自然科学基金项目（81270941）

2016-01-22

2016-03-07

Tel:010-66876369；E-mail:yeping301@sina.com