AdipoRon对2型糖尿病小鼠的治疗及其可能的肝脏机制*

肖 敏，屈小虎，李长西，吕聚坪，史 杨，谢克俭

AdipoRon对2型糖尿病小鼠的治疗及其可能的肝脏机制*

肖 敏，屈小虎，李长西，吕聚坪，史 杨，谢克俭△

（温州医科大学检验医学与生命科学学院 ，浙江温州325035）

目的:观察口服脂联素受体激动剂（AdipoRon）对2型糖尿病小鼠的治疗效果及对肝脏的影响。方法:40 只SPF级雄性C57/BL6小鼠随机分为正常对照组和实验组，实验组给予高糖高脂饲养联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素建立二型糖尿病（T2DM）小鼠模型，随机分为模型对照（DM）组，低剂量AdipoRon治疗（DM+L）组，高剂量AdipoRon治疗（DM+H）组（n=10）。检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的变化；HE染色镜下观察肝细胞形态学变化；实时定量荧光PCR法检测肝脏中肝糖类相关基因（PEPCK）的表达。结果:与DM组小鼠比较，DM+H组和DM+L组小鼠ALT、AST、ALP、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）水平均降低（P＜0.05）；与DM组小鼠比较，DM+H组小鼠和DM+L组小鼠血清游离脂肪酸（FFA）浓度显著下降（P＜0.05），而肝组织葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-P）活性DM+L组小鼠显著下降，DM+H组小鼠无显著差异；与DM组小鼠比较，DM+H组小鼠肝组织磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表达显著降低（P＜0.05），而DM+L组小鼠无显著差异。结论:给予AdipoRon治疗的小鼠血糖降低，ALT、AST、ALP的水平及G-6-P和PEPCK的表达下降，表明AdipoRon对2型糖尿病具有显著的治疗效果，对糖尿病小鼠肝脏有一定的保护作用。

2型糖尿病；脂联素受体激动剂；肝细胞损伤；小鼠

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.002

胰岛素敏感性降低即胰岛素抵抗是2型糖尿病发病机制的重要环节。胰岛素敏感组织的葡萄糖摄取量减少和胰岛β细胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理学改变。目前发现脂联素受体激动剂AdipoRon作为脂联素受体激动剂具有抗糖尿病生物学活性。研究［1］表明脂联素受体激动剂（AdipoRon）通过多条信号通路，加快了肌肉组织中游离脂肪酸的氧化和葡萄糖的转运 ，实现增加脂肪酸的β氧化、改善胰岛素抵抗［2］和抗炎等生物学作用。同时在肝脏中增强脂肪氧化，从而降低脂质合成发挥抗氧化作用。研究发现，在小鼠骨骼肌组织中AdipoRon通过结合AdipoR1/2，可抑制体内的糖异生，促进脂肪代谢［3，4］。本研究通过检测丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甘油三酯（triglyceride，TG）、葡萄糖（glucose，GLU）、游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-P）等一系列指标，观察肝组织HE染色形态，实时定量荧光PCR分析磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 （phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPCK）mRNA等基因产物表达，旨在探究AdipoRon对肝脏组织抗损作用的影响，为临床治疗2型糖尿病提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:SPF级雄性C57BL/6小鼠40只，体重20 g，购自中国科学院上海实验动物中心。

1.1.2 实验仪器:博士医生TD-4252血糖测试仪（日本京都），全自动生化分析仪（日本日立公司），CT15RE型台式微量高速离心机（日本日立公司），NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪（Thermo），S1000TMThermal Cycler梯度PCR仪（Bio-Rad），Multifuge XIR台式高速大容量冷冻离心机（Thermo），CFX ConnectTM荧光定量PCR检测系（Bio-Rad）

1.1.3 实验试剂:链脲佐菌素（购于上海恩美生物科技有限公司），AdipoRon（购于上海恩美生物科技有限公司），Trizol（invitrogen），PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara），SYBR Green （Bio-Rad），PEPCK and actin Primers（上海生工设计）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立及分组 40只SPF级雄性C57/ BL6小鼠（适应性喂养1周，随机分为正常对照NC 组10只和实验组30只，NC组给予常规饲料，实验组给予高糖高脂饮食（常规饲料66.5%+20%红糖+10%猪油+2.5%胆固醇+1%胆酸盐）饲养。5周后，禁食12 h，腹腔注射1%链脲佐菌素40mg/kg诱导糖尿病模型，72 h后禁食4 h，断尾取血测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）。血糖浓度 ＞11 mmol/L，且出现多饮、多食、多尿症状证明糖尿病鼠模型诱导成功。正常对照组腹腔注射等容积柠檬酸钠缓冲液。最终实验组建模成功30只，分为模型对照（DM）组、低剂量AdipoRon治疗（DM+L）组、高剂量AdipoRon治疗（DM+H）组。

1.2.2 干预及标本采集 将AdipoRon溶于去离子水，DM+L组小鼠灌胃AdipoRon，剂量为1.25 mg/ kg，DM+H组小鼠灌胃AdipoRon，剂量为6.25 mg/ kg，每日1次，NC、DM组灌胃等量去离子水。干预10 d后，禁食4 h，断尾取血测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）。摘眼球取血0.6 ml，分离上清于干净的离心管中，保存于-4℃。取各组肝脏标本并编号，部分4%多聚甲醛固定，部分保存在-80℃。

1.2.3 生化指标测定 由全自动生化分析仪检测各组血清中ALT、AST及ALP、TG、GLU的含量。

1.2.4 病理学观察 取各组4%多聚甲醛固定的肝脏标本，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，制成5μm切片，HE染色。用ECTIPSE 50I显微图像处理系统观察并采集图像，观察各组肝脏组织形态变化。

1.2.5 G-6-P和FFA含量的测定 ELISA试剂盒检测小鼠肝组织G-6-P、FFA的水平。

1.2.6 肝组织糖代谢相关基因表达测定 采用Trizol一步法提取小鼠肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，操作遵照试剂盒说明书，用实时荧光定量PCR测定肝磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）mRNA表达，以β-actin为内参。PEPCK上游引物:5'-TGA AAGGCCGCA CCA TGTAT-3'；PEPCK下游引物:5'-GCA CAG ATA TGC CCA TCC GA-3'。β-actin上游引物:5'-AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC-3'；β-actin下游引物:5'-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC-3'。反应体系20μl:SYBR Green（2×）10μl，10 μmol/L上下游引物各0.4μl，ddH2O 7.2μl，模板0.2 μl。反应条件:95℃变性30 s；循环40次:95℃变性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸34 s；融解:95℃15 s，60℃1min，95℃15 s；冷却:60℃15 s。

1.3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用独立样本 t检验。

2 结果

2.1 4组小鼠生化指标比较

与NC组小鼠相比，DM组、DM+L组及DM+H小鼠 ALT、AST、ALP、TG、GLU水平均升高（P＜0.05），与DM组相比，DM+H组和DM+L组小鼠ALT、AST、ALP、TG、GLU水平均降低（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Comparison of biochemical indices among the four groups（±s，n=10）

Tab.1 Comparison of biochemical indices among the four groups（±s，n=10）

NC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L:Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetesmodel controlwith high AdipoRon；ALT:Alanine aminotransferase；AST:Aspartate aminotransferase；ALP:Alkaline phosphatase；TG:Triglyceride；GLU:Glucose*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group

Group　ALT（U/L）　AST（U/L）　ALP（U/L）　TG（mmol/L）　GLU（mmol/L）NC　50.80±5.79　154.90±19.05　92.80±9.73　1.09±0.22　7.53±1.21 DM　92.00±13.97*　295.10±32.89*　164.90±15.15*　2.72±0.47*　20.83±2.61*DM+L　73.50±8.78#　226.70±21.44#　138.00±14.39#　1.96±0.16#　16.42±0.96#DM+H　60.90±15.65#　173.10±14.00*#　101.30±11.89#　1.48±0.26*#　11.05±0.86*#

2.2 小鼠肝组织病理学检查

光镜观察，NC组肝小叶结构未见明显异常，肝细胞索排列整齐，未见明显脂肪变性及炎细胞浸润；DM组肝小叶结构紊乱，肝细胞明显脂肪变性，肝细胞胞浆内出现大量小空泡；DM+H组和DM+L组有不同程度的减轻（图1，见彩图页Ⅰ）。

2.3 4组肝组织G-6-P和血清FFA浓度比较

与NC组小鼠相比，DM组小鼠肝组织G-6-P，血清FFA水平均显著升高（P＜0.05）。与DM组小鼠相比，DM+H组和DM+L组小鼠血清FFA浓度显著下降（P＜0.05），肝组织G-6-P浓度DM+H组小鼠显著下降（P＜0.05），DM+L组无显著差异 （表2）。

Tab.2 Comparison of average concentration ofG-6-P in liver and FFA in serum among four groups（±s，n =10）

Tab.2 Comparison of average concentration ofG-6-P in liver and FFA in serum among four groups（±s，n =10）

NC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L: Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetesmodel control with high AdipoRon；G-6-P:Glucose-6-phosphatase；FFA:Free fatty acids*P＜0.05 vs NC group；#P＜0.05 vs DM group

Group　G-6-P FFA NC　68.80±13.26　163.50±14.84 DM　84.70±10.04*　213.10±39.33*DM+L　78.10±10.22　153.70±17.61#DM+H　72.40±10.51#　159.90±17.44#

2.4 4组肝脏糖代谢相关酶mRNA表达水平变化

DM组小鼠肝组织PEPCK mRNA表达与NC组小鼠比较显著升高（P＜0.05）。与DM组小鼠相比，DM+H组和DM+L组小鼠肝组织PEPCKmRNA表达显著降低（P＜0.05），与DM+L组相比，DM+H组小鼠肝组织PEPCK mRNA表达无显著差异（图2）。

3 讨论

研究显示，胰岛素抵抗可导致脂肪细胞溶解加速，从而使血液中游离脂肪酸含量增加，超过线粒体β氧化链负荷，从而使脂肪酸积聚在肝脏，造成肝细胞脂肪变性。本实验结果显示，糖尿病小鼠表现高血糖、高血脂，血中AST、ALT升高，肝细胞结构出现异常等病理特征，说明高脂饮食加小剂量链脲佐菌素已成功构建2型糖尿病模型。

Fig.2 Comparison of PEPCK expression in the tissues among the four groupsNC:Normal control；DM:Diabetesmodel control；DM+L: Diabetesmodel controlwith low AdipoRon；DM+H:Diabetes model control with high AdipoRon；PEPCK:Phosphoenolpyruvate carboxylase

2013年，东京大学药物研究所的Okada-Iwabu教授等对大量能够结合并激动脂连素受体的小分子化合物进行了筛选。他们根据这些小分子化合物是否具有激活AMPK的能力，选出与脂连素作用相似的小分子化合物，并将其命名为AdipoRon。脂连素受体抑制剂AdipoRon对肌肉和肝脏的影响与脂连素（adiponectin，APN）的作用非常相似。脂联素，又称apM1、Acrp30、GBP21或Adiop，为脂肪组织分泌的脂肪因子，是一种脂肪组织特异性糖蛋白。1995年Scherer等［5］首先从鼠的脂肪细胞分离出来 ，当时命名为Acrp30；1996年Nakano等［6］在人脂肪细胞中得到Acrp30的类似物；1999年Arita等［7］将其命名为脂联素，并建立了可测定人的血浆中脂联素浓度的方法。研究表明，脂联素对胰岛有显著的保护作用。此外，糖尿病并发症的发生、发展也与脂联素降低有密切关系，如大血管病变及早期肾病，其患者的血清脂联素浓度明显低于单纯糖尿病患者。本实验中，在注射AdipoRon后，血中相关指标ALT、AST、ALP、TG、GLU的水平下调，肝组织的G-6-P，PEPCK的表达下降，具有显著的2型糖尿病治疗效果。国外已有研究发现脂联素在大鼠体内可通过抑制PEPCK 和G-6-PmRNA表达，降低肝糖生成，减少肝糖输出［8］。

肝脏是糖代谢重要的场所，肝细胞葡萄糖摄取、糖原合成等均需要胰岛素介导，胰岛素是PEPCK最重要的负性调节激素，PEPCK促糖异生，当胰岛素抵抗时，肝糖异生的抑制作用降低，以及G-6-P调控着糖原的分解，出现胰岛素抵抗时，胰岛素对糖异生的关键酶抑制作用减弱，使G-6-P和PEPCK mRNA表达含量增加从而使血糖水平升高。肝脏PEPCK 和G-6-P决定着机体葡萄糖的稳态，过度表达可扰乱整个糖脂稳态，诱导葡萄糖失耐受与外周胰岛素抵抗［9，10］。凌红艳等人［11］也认为用高果糖和高脂饲料诱导的2型糖尿病大鼠模型PEPCK和G-6-P显著高表达。钟灵等人［12］同样认为增强肝葡萄糖激酶G-6-P活性发挥降血糖作用。在本实验中，荧光PCR结果提示给予AdipoRon治疗的小鼠增加了肝脏IS胰岛素敏感性，通过抑制PEPCK活性而抑制糖异生。

综上所述，本研究通过构建模型并结合细胞观察，研究相关指标变化，肝脏中肝糖类相关基因的表达的改变，证明AdipoRon作为以胰岛素敏感性下降治疗的新靶点开发出的特异药物，将会有很高的临床价值和应用前景。

［1］Okada-Iwabu M，Yamauchi T，Iwabu M，et al.A smallmolecule AdipoR agonist for type 2 diabetes and short life in obesity［J］.Nature，2013，503（7477）:493-499.

［2］Reaven G.Insulin resistance and coronary heart disease in nondiabetic individuals［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（8）:1754-1759.

［3］Iwabu M，Yamauchi T，Okada-Iwabu M，et al.Adiponectin and AdipoR1 regulate PGC-1alpha andmitochondria by Ca2+and AMPK/SIRT1［J］.Nature，2010，464（7293）:1313-1319.

［4］Tanabe H，Motoyama K，Ikeda M，et al.Expression，purification，crystallization，and preliminary X-ray crystallographic studies of the human adiponectin receptors，AdipoR1 and AdipoR2［J］.JStruct Funct Genomics，2015，16（1）: 11-23.

［5］Scherer PE，Williams S，Fogliano M，et al.A novel serum protein similar to C1q，produced exclusively in adipocytes ［J］.JBiol Chem，1995，270（45）:26746-26749.

［6］Nakano Y，Tobe T，Choi-Miura NH，et al.Isolation and characterization of GBP28，a novel gelatin-binding protein purified from human plasma［J］.JBiochem，1996，120（4）: 803-812.

［7］Arita Y，Kihara S，OuchiN，et al.Paradoxical decrease of an adipose-specific protein，adiponectin，in obesity［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999，257（1）:75-79.

［8］龚 明，李超林，肖 谦 ，等.脂联素对大鼠肝细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响的研究［J］.重庆医科大学学报，2005，40（4）:567-569.

［9］吉 柳，汤新强，彭金咏，等.基于糖代谢酶调节作用的中药抗糖尿病研究进展［J］.中国中药杂志，2012，58（23）:3520-3525.

［10］文 艺 ，祁 巧，冯 犁，等.Roux-en-Y胃旁路术后对2型糖尿病大鼠肾脏胰岛素受体表达的影响及意义［J］.中国糖尿病杂志，2015，23（27）:1-7.

［11］凌宏艳，姚起鑫，亓竹青，等 .槟榔碱对2型糖尿病大鼠肝脏胰岛素抵抗的作用［J］.中国应用生理学杂志，2014，30（3）:208-212.

［12］钟 灵 ，王振富，李玉山，等.恩施绿茶茶多糖对糖尿病大鼠血糖的影响［J］.中国应用生理学杂志，2013，29（1）:77-80.

AdipoRon for the treatment of type 2 diabetes in mice and its possible mechanism of the liver

XIAOMin，QU Xiao-hu，LIChangi，LV Ju-ping，SHIYang，XIE Ke-jian△
（Department of Biology，School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

【ABSTRACT】Objective:To observe the effectof AdipoRon for the treatmentof type 2 diabetes（T2DM）inmice and its effecton the liver. Methods:Fortymale C57/BL6mice（SPF）were randomly divided to normal control（NC）group and the experimentalgroup.To establish the T2DM micemodel，mice in the experimentalgroupwere fedwith high fatand high glucose，combinedwith intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）in small doses，andmicewere further subdivided intomodel control（DM）group，model controlwith low AdipoRon（DM+L）group andmodel controlwith high AdipoRon（DM+H）group（n=10）.Serum indexes，such as levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP）were detected biochemically and themorphological changesof liver cellswere observedwith HE staining and expression of liver carbohydrate related gene（PEPCK）were determined by real-time fluorescence quantitative PCR（real time FQ-PCR）.Results:Comparedwithmice in the DM group，levelsof ALT，AST，ALP，triglyceride（TG），glucose（GLU）reduced in DM+L and DM+H group（P＜0.05）.Concentrations of serum free fatty acids（FFA）in DM+L and DM+H group reduced significantly（P＜0.05）.Besides，concentrations of liver glucose-6-phosphatase（G-6-P）in themice of DM+L group reduced significantly，while therewas no significant difference in the contentofG-6-Pbetween themiceof DM+H group and themice of DM group.Furthermore，the expression of the liver phosphoenolpyruvate carboxylase（PEPCK）in the DM+H group reduced significantly（P＜0.05）.Comparedwith the DM group no significant changewas found in the PEPCK expression between DM+L and DM group.Conclusion:The serum indexes such as levels of ALT，AST，ALP，TG，Glu，G-6-Pand PEPCK were all reduced in DM mice treatedwith AdipoRon，indicating the obvious protecting effectof AdipoRon on the liver in DM mice.

type 2 diabetes； adiponectin receptor excitomotor； liver cell injury； mice

R587.1

A

1000-6834（2016）03-198-04

2015年度浙江省公益技术应用研究计划（实验动物）项目（2015C37099）

2015-11-24

2016-02-14

Tel:13705883181；E-mail:xkj@wmu.edu.cn