薯蓣皂苷对大鼠心肌收缩与钠-钙交换体的影响*

杨 帆，韩 钰，丛恬马先，康 毅，李 燕，孙 凯，尹永强，娄建石

薯蓣皂苷对大鼠心肌收缩与钠-钙交换体的影响*

杨 帆，韩 钰，丛恬马先，康 毅，李 燕，孙 凯，尹永强△，娄建石△

（天津医科大学基础医学院药理学教研室 ，天津300070）

目的:观察薯蓣皂苷（Dio）对大鼠心肌收缩作用以及胞内Ca2+浓度的影响 ，并初步探讨其作用机制与Na+-Ca2+交换体（NCX）的关系。方法:采用Langendorff逆行主动脉灌流法对大鼠离体心脏进行灌流，利用压力感受器插管法测定左心室相关心功能参数，记录及其在应用NCX选择性抑制剂SEA0400情况下对左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末期压（LVEDP）、左心室内压最大上升/下降速率（±dp/dtmax）以及心率（HR）的影响；利用激光共聚焦显微观察薯蓣皂苷及SEA0400对大鼠心肌细胞H9c2细胞内Ca2+浓度的影响。结果:离体心脏灌流结果显示，1μmol/LDio可显著增加LVSP，增加约19.7%（P＜0.01）；增加左室内压最大上升速率（+dp/dtmax），增加约9.6% ；激光共聚焦测定Ca2+荧光强度实验结果显示:1μmol/L Dio可使H9c2细胞中Ca2+相对荧光强度增加（P＜0.01）；而在SEA0400存在的情况下，1μmol/L的Dio使细胞内Ca2+相对荧光强度变为（17.09±0.63），给予Dio后差异有显著性（P＜0.01）。在细胞液中无Ca2+或无Na+时，给予1μmol/L的Dio使Ca2+相对荧光强度减小，与给予1 μmol/L的Dio差异有显著性（P＜0.01）。结论:Dio可增加左心室收缩压和最大上升速率，表现正性肌力作用；Dio可使细胞内Ca2+浓度增加，其作用机制与增加Na+内流 ，促进NCX反向转运有关。

薯蓣皂苷；心肌；大鼠；正性肌力作用 ；Na+-Ca2+交换体

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.005

药物的作用靶点在一定程度上决定了药物疗效。目前发现的与心肌收缩作用相关靶点［1］有很多，包括β肾上腺素受体［2］、磷酸二酯酶、L-型钙通道、蛋白激酶A、蛋白激酶C、蛋白磷酸酶、Na+-K+-ATP酶［3］、Na+-Ca2+交换体（sodium-calcium exchanger，NCX）、肌浆网钙泵［4］、兰尼定受体、三磷酸肌醇受体等。其中，NCX作为调节细胞内钙离子平衡的重要途径之一，与心肌收缩作用存在着密不可分的关系［5］。现代研究［6-9］证实 ，Dio具有改善心血管功能、降血脂、抗血小板聚集以及抗肿瘤、调节免疫等多种药理作用。但Dio产生正性肌力作用及其具体机制尚未见报道。化合物SEA0400（2-［4-［（2，5-difluorophenyl）methoxy］phenyl］-5-ethoxyaniline）是近年来发现的一类NCX选择性阻断剂 ，研究［10-13］表明，正常心肌细胞 25%的 Ca2+都是由 NCX外排，1μmol/L SEA0400可以抑制80%以上的Na+-Ca2+交换，对心肌细胞上其他离子通道、受体和转运蛋白没有影响。本实验室研究了Dio对大鼠离体心脏的正性肌力作用，发现Dio能够增加心脏收缩力，可增加心肌细胞内Ca2+浓度。本实验利用SEA0400作为模型药物，探讨Dio增加心肌收缩力和心肌细胞内Ca2+浓度的机制，以大鼠离体灌流心脏和心肌H9c2细胞为载体，观察Dio正性肌力作用和细胞内Ca2+浓度的变化，初步研究正性肌力作用与NCX之间的关系，为正性肌力药物的探索提供新的发现与科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

大鼠心肌细胞H9c2细胞株（中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心）。健康、成年Wistar大鼠，雄性，体重250～300 g，合格证号SCXK（京）2012-0004，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2 主要仪器和试剂

仪器:PK-600S型恒温水浴锅；2℃～8℃药品保存冰箱；电热鼓风干燥箱；微量加样器；pH计；倒置荧光显微镜；Gemini XPS荧光读板机；24孔板；0.22 μm微孔滤膜；共聚焦培养皿；GL-2 Langendorff灌流装置；BL420-F生物机能实验系统；HW-1000超级恒温水浴。

试剂:薯蓣皂苷（国家天然药物研究中心）；SEA0400（MedChem Express，USA）；低糖DMEM培养基（HyClone，USA）；胎牛血清（Gibco，USA）；胰蛋白酶（HyClone，USA）；双抗（青霉素及链霉素溶液100×）（北京索莱宝科技有限公司）；Fluo3-AM钙离子荧光探针（碧云天）；JC-1荧光探针（碧云天）。

1.3 大鼠左心室功能测定

1.3.1 实验分组:1μmol/L Dio组；1μmol/L SEA0400组；1μmol/L SEA0400+1μmol/L Dio组。以给药前5min作为正常对照，给药后20 min作为给药组。

1.3.2 离体心脏 Langendorff灌流法用25%乌拉坦1.0 g/kg麻醉大鼠，仰位固定于鼠台上，迅速剪开胸腔，暴露心脏，从主动脉根部离断取出心脏，放入4℃生理盐水中，轻轻按压，帮助泵出残留血液并去除脂肪及结缔组织。行主动脉逆行插管，注意插管不宜过深，不得超过动脉口进入心腔。将插管连接Langendorff灌流装置上，使用注射器快速注入4℃生理盐水，排尽残血，再以恒温（37℃）、充氧（95%O2± 5%CO2）的K-H液8ml/min连续灌流，灌注压为60 ～70mmHg左右。灌注K-H液。整个过程控制在1min以内，以减少缺血对心脏组织造成的损伤。待心脏逐渐恢复跳动，轻轻剪掉左心耳，采用插管法将球囊压力感受器探头经左心房插入左心室。实验中选择乳胶薄膜制作球囊，因其扩展能力好，变形能力强，对心室压力的变化更为敏感。压力感受器经压力换能器与BL420生物机能实验系统相连，用于记录左心室收缩曲线，采样频率为800/s。待心脏灌流稳定20min后给药。

1.3.3 观测指标 主要观察心肌最大缩短速率（maximum shortening velocity，Vmax）、心率（heart rate，HR）、左心室收缩压（left venteicular systolic pressuer，LVSP）、左心室舒张末期压（left ventricular end dilated pressure，LVEDP）、左心室压力上升最大速率（+dp/ dtmax）、左心室压力下降最大速率（-dp/dtmax）等指标。

1.4 细胞内Ca2+浓度的测定

1.4.1 Fluo3-AM工作液的配制 （1）母液配制:用44.2μl DMSO溶解50μg的Fluo3-AM粉末，配制成1mmol/L母液，分装，封口避光，-20℃保存。（2）Fluo3-AM工作液的配制:用1ml台氏液稀释4μl母液即可得到浓度为4μmol/L Fluo3-AM的工作液。无Na+、无Ca2+组则分别采用不含Na+、不含Ca2+的台式液稀释。

1.4.2 测定方法 （1）以8×104cells/ml的密度将细胞接种于共聚焦培养皿中，于37℃、5%CO2孵箱中培养24 h后，进行给药处理，与药液共孵育时间为20min。（2）取各组细胞，弃去旧培养液，以1 ml台氏液轻轻洗涤三遍。（3）加入500μl含4μmol/L Fluo3-AM的工作液，放入37℃、CO2孵育箱中避光负载30min。（4）在负载结束后，用1ml台氏液轻轻洗涤细胞3遍，充分去除残留的工作液。最后向激光共聚焦培养皿中的各组细胞加入1ml台氏液，避光孵育20～30 min，以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用。（5）共聚焦显微镜Ca2+成像:加载好荧光指示剂的细胞置于激光共聚焦显微镜系统的载物台上，在激发光488 nm处，可于525 nm处探测到荧光。选取固定视野摄影记录最大荧光信号，经光电倍增管和数字传入式摄像机，输入计算机系统，利用Image J软件计算胞内平均荧光强度，以此衡量H9c2细胞内游离Ca2+水平。荧光强度越大，表示细胞内游离Ca2+越高。以上步骤均在37℃条件下进行。

1.4.3 实验分组 （1）正常对照组；（2）1μmol/L Dio组；（3）1μmol/L SEA0400组；（4）1μmol/L SEA0400+1μmol/L Dio组；（5）1μmol/L Dio+无Na+台氏液组；（6）1μmol/L Dio+无Ca2+台氏液组（其中无Na+台氏液配制时使用LiCl替代NaCl）。

1.5 数据处理

2 结果

2.1 大鼠左心室收缩功能测定

1μmol/L Dio可显著增加LVSP，由（80.34± 2.07）mmHg至（96.13±3.79）mmHg，增加近19.7% （P＜0.01）；+dp/dtmax由（3.01±0.53）mmHg/ms增至（3.30±0.16）mmHg/ms，增加约9.6%（P＜0.05，图1）。

给予1μmol/L SEA0400+1μmol/L Dio的LVSP由（80.25±5.61）mmHg/ms上升为（81.79±9.35）mmHg/ms，+dp/dtmax由（2.83±0.09）mmHg/ms变为（2.83±0.25）mmHg/ms，与正常对照组相比无明显变化。将给药后各功能指标数值分别除以给药前正常对照组功能指标数值，得出变化比值（P＜0.05，P ＜0.01，表1）。

Fig.1 Effectsof dioscin on LVSPof isolated Langendorff-perfused ratheart in the absence and presence of SEA0400LVSP:Left veatricular systolic pressure

Tab.1 Effects of SEA0400 and dioscin on cardiac functions in isolated ratheart

2.2 细胞内Ca2+浓度测定

荧光探针Fluo3-AM与H9c2细胞共孵育后，与Ca2+相结合产生较强的荧光（图2）。与正常对照组相比，SEA0400使细胞内Ca2+荧光强度降低，从（17.30±0.92）下降到（7.94±0.57）；Dio能显著增强Ca2+荧光强度，从（17.30±0.92）上升到（26.90± 0.71）；SEA0400+Dio组与正常对照组差别不大，分别为（17.30±0.92）与（17.09±0.63）；与Dio组相比，无Ca2++Dio组和无Na++Dio组均使细胞内Ca2+荧光强度显著降低，从（26.90±0.71）下降到（8.17±0.50）和（12.73±0.39）（P＜0.01，图3）。

3 讨论

本室前期实验研究发现Dio对乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤具有保护作用，可增强大鼠缺血再灌注损伤后的心肌抗氧化能力［14］；在离体水平上，也有研究［15］证实Dio衍生物可改善SD大鼠离体心脏左心室收缩功能，对缺血再灌注损伤具有明显保护作用。在此基础上，本实验于离体和细胞水平，从心功能指标、生化指标角度证明了Dio具有正性肌力作用，且其机制与促进NCX反向运转，诱发Na+外排，继而促使Ca2+交换内流入胞有关。

心肌细胞接受脉冲信号后，Na+通道首先被激活开放，Na+大量内流，然后激活Ca2+通道，导致外Ca2+内流，继而激活胞内肌浆网释放Ca2+。此时，NCX根据细胞膜电位以及细胞内外Na+与Ca2+的浓度，采取两种转运方式:正向转运，即Ca2+外排耦联Na+内流；反向转运，即Ca2+内流耦联Na+外排。当抑制NCX正向转运，或促进NCX的逆向转运，使细胞Ca2+内流增加，产生正性肌力作用［1］。文献报道［16］，临床上使用的洋地黄类药物通过抑制心肌Na+-K+-ATP（NKA）酶的活性，使钠泵失灵、细胞内Na+增多，从而促进Na+-Ca2+交换。本实验室之前的实验研究显示［17］，Dio可激活Na+通道，使Na+内流。因此笔者首先考虑细胞内Ca2+升高可能与NCX有关。

Fig.2 Effects of Dioscin on the fluorescence intensity of intracellular calcium ion in H9c2 cells （×100）

Fig.3 Effects of dioscin on the fluorescence intensity of intracellular calcium ion in H9c2 cellsDio:Dioscin；SEA0400:2-［4-［（2，5-difluorophenyl）methoxy］phenyl］-5-ethoxyaniline

Farkas等［18］发现，1μmol/L SEA0400对正常兔离体心脏心肌收缩力无明显影响，这与本实验结果一致。即单独给予Dio时，正性肌力作用明显，共同给予SEA0400和Dio时，与正常组相比几乎无变化，但比单独给予 Dio时变化比值显著降低，说明SEA0400可削弱Dio的正性肌力作用。细胞水平实验结果显示，单独给予Dio时细胞内Ca2+浓度升高，共同给予SEA0400和Dio时，细胞内Ca2+浓度与正常水平无太大差别，说明SEA0400可部分阻断Dio升高细胞内Ca2+的能力，提示Dio产生心肌正性肌力作用，升高细胞内Ca2+浓度与NCX有关。其次，为进一步证明与NCX的联系，考虑到细胞外Na+或Ca2+对实验的影响，本实验设计了无Na+或无Ca2+细胞外液。当细胞外无Ca2+时，Dio不能升高细胞内Ca2+浓度，提示促进外Ca2+内流可能是其升高细胞内Ca2+浓度的机制之一；当细胞外无Na+时，Dio也不能使细胞内Ca2+浓度升高，表明促进Na+内流与其升高细胞内 Ca2+离子浓度密切相关。在SEA0400阻断NCX或细胞外液没有Na+或Ca2+时，Dio升高细胞内Ca2+浓度的作用均被阻断。笔者的实验证实Dio可升高细胞内Ca2+浓度，据此推断Dio增强心肌收缩力的作用与增强NCX反向转运有关。

本实验研究的Dio正性肌力作用机制与传统的正性肌力药物不同，为Dio的药理作用研究提供了新的发现与科学依据。然而，Dio促进Ca2+内流、引起细胞内Ca2+水平升高继而增强心肌收缩力是否存在其他机制以及是否会导致Ca2+超载等问题，是笔者今后深入探索的方向。

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The effects of dioscin on myocardial contraction and sodium-calcium exchanger

YANG Fan，HAN Yu，CONG Tian-shen，KANG Yi，LIYan，SUN Kai，YIN Yong-qiang△，LOU Jian-shi△
（Department of Pharmacology，Basic Medical College，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

【ABSTRACT】Objective:To investigate the inotropic effectsof dioscin（Dio）in rat isolated-heartand intracellular free calcium concentration in isolated ratventricularmyocytes and to explore itsmechanism preliminarily.Methods:Leftventricle contractile functionwasmeasured using the Langendorff non-recirculatingmode of isolated rat heart perfusion.Effects of dioscin and dioscin+SEA0400，sodium-calcium exchanger （NCX）inhibitor，were investigated by measuring left ventricular systolic pressure（LVSP）and left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）.Also，heart rate（HR），peak rateof rise/fallof leftventricular pressure（±dp/dtmax）of isolated ratheartwere calculated；Effects of dioscin and SEA0400 on intracellular free calcium concentration in ratH9c2 cellsweremeasured by Fluo3-AM and then detected the fluorescence intensitywith confocalmicroscopy.Results:With 1μmol/L dioscin，LVSPwas significantly increased by 19.7%（P＜0.01）and dp/ dtmaxwas increased by 9.6%；With 1μmol/L dioscin，the relative fluorescence intensity of intracellular free calcium concentrationswere strong significantly（P＜0.01）.While in presence of SEA0400，the relative fluorescence intensitywas changed to 17.09±0.63（P＜0.01）by 1μmol/L dioscin.With 1μmol/L dioscin，the relative fluorescence intensitywasweak（P＜0.01）without calcium or sodium in the extracellular fluid.Conclusion:Dioscin shows positive inotropic effecton isolated ratheart，enhancing the LVSPand+dp/dtmax；Dioscin increases the intracellular concentration ofCa2+in the cardiacmyocytesby increasing Na+influx and facilitating the reversemode of the sodium-calcium exchanger.

dioscin； myocardium； rat； positive inotropic effect； sodium-calcium exchanger

R331.3

A

1000-6834（2016）03-209-05

天津应用基础及前言技术研究计划青年项目（14JCQNJC13700）

2015-11-12

2016-02-01

Tel:022-83336835，022-83336860；E-mail:13820043633 @126.com，jianshilou@163.com