运动对2型糖尿病大鼠血清生物标记物时序性特征的代谢组分析*

李 蕾，金其贯，胡振东，薛 鹏

运动对2型糖尿病大鼠血清生物标记物时序性特征的代谢组分析*

李 蕾1△，金其贯2，胡振东1，薛 鹏1

（1.淮北师范大学体育学院 ，安徽 淮北235000；2.扬州大学体育学院 ，江苏扬州225009）

目的:分析2型糖尿病大鼠在运动干预不同时点的血清生物标记物组合特征。方法:100只SD大鼠 ，随机选取90只高糖高脂饲料喂养4周，40mg/kg体重腹腔注射链脲佐菌素（STZ）造模，稳定1周后，71只大鼠成模。最后进入实验共81只大鼠。实施三个时点游泳运动干预（2周、4周和8周）。实验设计共分8组，具体如下:正常对照组（C0组，n=10）；糖尿病模型对照组（DC0组，n=10）；糖尿病模型对照2周组（DC2组，n=10）；糖尿病模型对照4周组（DC4组，n=10）；糖尿病模型对照8周组（DC8组，n=9）；糖尿病运动干预2周组（DE2组，n=11）；糖尿病运动干预4周组（DE4组 ，n=10）；糖尿病运动干预8周组（DE8组 ，n=11）。采用UPLC/Q-TOFMS技术对大鼠血清进行代谢组学检测，分析运动干预三个时点血清生物标记物的组合特征。结果:依据变化倍数大小排列组合，形成运动干预三个时点的血清生物标记物组合。这些血清生物标记物组合中，大部分差异性物质在不同时点同时出现，但变化倍数有明显不同。2周时点单甘油酸酯的变化倍数最明显，4周时点葡糖酸的变化倍数最明显，4～8周时点二十碳五烯酸、亚麻酸含量可回归至正常水平。结论:2型糖尿病大鼠运动干预不同时点血清生物标记物组合呈现出一定特征。二十碳五烯酸、亚麻酸是运动干预三个时点中上调显著的共同物质，单甘油酸酯、葡糖酸、丙基肉碱、精氨酸、1-磷酸鞘氨醇是三个时点中下调显著的共同物质。

运动干预；时序性；2型糖尿病；大鼠；生物标记物

【DOI】10.13459/j.cnki.cjap.2016.03.017

我国2型糖尿病（T2DM）患病率高达9.7%，且仍呈上升趋势，已成为世界糖尿病第一大国［1］。与药物干预机制不同的是，运动干预呈现“多靶点”、“非特异性”、“密切对话”、“突出整体”等特点。传统单靶点作用的药物研究模式不一定适用于运动调节机制的研究［2］。而代谢组学的“全景式”扫描，具有方法学优势。“运动代谢组学”（sportomics）的提出［3，4］，进一步启示我们研究运动干预后代谢物图谱的时间变化轨迹（生物标记物的时序性变化），从而获得生物体运动干预过程中机能的完整信息。已有的文献以急性运动偏多［5-14］，慢性运动很少［15］。尤其缺少慢性病动物模型的纵向研究。本研究建立2型糖尿病动物模型，基于代谢组学方法探讨运动干预不同时点大鼠血清生物标记物组合特征，为认识运动干预随时间推进的累积效应提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（货号:S0130）和亮氨酸-脑啡肽购自Sigma公司；LC/MS级乙腈购自 Merck公司，UPLC级甲醇购自 Merck公司（Dannstadt，Gennany）；甲酸购自CNW公司；其余试剂为市售分析纯。实验用水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 实验仪器

超高效液相色谱系统（Agilent，1290 Infinity UPLC）；质谱检测为四级杆飞行时间质谱（6530 UHD and Accurate-MassQ-TOF/MS）；分离色谱柱为C18色谱柱（Agilent，100mm×2.1mm，1.8μm）。FRESCO 17离心机（ThermoFisher Scientific）；SK5200HP超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；Mettler AE240天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；EYEL MG-2200氮吹仪（TOKYO RIKA KIKAL C0LTD）；Tissuelyser-24研磨仪（上海净信科技）；VORTEX涡旋仪（LABNET）。

1.3 实验动物造模与取材

100只5周龄雄性SD大鼠（140～160 g），购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，饲养于扬州大学动物实验中心，每日光照12 h，室温（24±0.8）℃，相对湿度60%，自由饮水摄食。适应性喂养7 d后，通过随机数字表随机选取90只大鼠予以高糖高脂饲料喂养4周，之后以40 mg/kg体重实施腹腔注射STZ造模，观察大鼠饮食、体重、尿量等生理指标，稳定1周后剪尾取血测定空腹血糖和随机血糖（夜间不禁食，9∶00测随机血糖，之后禁食6 h，15∶00测空腹血糖），以空腹血糖≥11.1 mmol/L并结合随机血糖判断糖尿病大鼠模型造模成功。10只大鼠给予适量生理盐水腹腔注射对照，作为正常对照组（C0组），普食喂养至实验结束。

将造模成功的71只大鼠按血糖水平筛选分层，并匹配不同干预时点随机分为以下7组:糖尿病模型对照组（DC0组，n=10）；糖尿病模型对照2周组（DC2组，n=10）；糖尿病模型对照4周组（DC4组，n =10）；糖尿病模型对照8周组（DC8组，n=9）；糖尿病运动干预2周组（DE2组，n=11）；糖尿病运动干预4周组（DE4组，n=10）；糖尿病运动干预8周组（DE8组，n=11）。所有大鼠普食喂养，运动组游泳运动干预，每周训练6 d，休息1 d，训练时间从20～60min不等的逐渐适应，到适应3 d后90min/d。各组大鼠分别于运动2周、4周、8周结束48 h后取材，取材前各组大鼠均禁食12 h。所有大鼠苯巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉，下腔静脉取血，离心取血清，-80℃冻存备用。

1.4 代谢组学分析

样本常温下解冻，取100μl置于1.5ml的离心管，加入0.5 ml低温甲醇，超声破碎，低温离心（15 000 r/min，5 min），吸取上清液；残渣中再次加入0.5ml的低温甲醇，重复上述步骤，合并上清液。取200μl上清于进样小瓶中待测。

色谱分离柱温为40℃；流速0.4ml/min；流动相组成A:水+0.1%甲酸，B:乙腈+0.1%甲酸；进样量为4μl，自动进样器温度4℃。质谱采用正负离子模式检测，毛细管电压4 kV（负离子模式3.5 kV）、锥孔电压35 kV（负离子模式50 kV）、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃（负离子模式300℃）、反向锥孔气流50 L/h、脱溶剂气体流量600 L/h（负离子模式700 L/h）、萃取锥孔4 V。离子扫描时间0. 03 s、扫描时间间隔0.02 s、数据采集范围:50～1 000m/z。亮氨酸-脑啡肽溶液作为锁定质量溶液。

1.5 统计学处理

代谢组学检测数据，导入Simca-P软件，根据OPLS模型中的变量重要性投影值和峰响应强度值的单维t检验筛选生物标记物。

2 结果

2.1 各组大鼠的空腹血糖水平

在运动干预4周时点，DE4组大鼠的空腹血糖水平显著低于DC4组大鼠（P＜0.05），表明运动干预4周时点，糖尿病大鼠空腹血糖的改善作用最明显（表1）。

2.2 OPLS-DA模式识别

采用正交-偏最小二乘投影判别分析（OPLSDA）模式识别方法区分C0组和DC0组，根据VIP值（VI P＞1），结合单维 t检验的P值（P＜0.05），通过搜索在线数据库（http://metlin.scripps.edu/），比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量数mass，最终对差异性表达代谢物（生物标记物）进行定性和鉴定可以看出C0和DC0，两组明显被分离开，表明C0组和DC0组之间的内源性代谢物存在明显差异（图1）。

Tab.1 Serum fasting blood glucose level in every groups（±s，n =9～11）

Tab.1 Serum fasting blood glucose level in every groups（±s，n =9～11）

FPG:Fasting plasma glucose*P＜0.05 vs DC4 group

Group　n　FPG（mmol/L）C0　10　8.1±0.5 DC0　10　14.0±5.5 DC2　10　23.98±5.84 DC4　10　26.2±7.8 DC8　9　11.11±6.96 DE2　11　17.6±8.57 DE4　10　10.41±2.85*DE8　11　9.24±2.81

Fig.1 OPLS-DA score plotof two groups

Tab.2 Fifteen significant differencemetabolites in group DE2 based on fold-change

2.3 基于代谢组学检测筛选的干预组不同时点生物标记物组合特征

我们分别鉴定出运动干预三个时点的生物标记物，并根据变化倍数从大到小的顺序再次筛选，取前15位物质组成每个时点的生物标记物组合作为本文分析讨论的物质（表2、表3、表4）（除去重复出现的物质，最终筛选出的物质总数是22个）。与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠体内的二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、亚麻酸（linolenic acid，LA）、磷酸胆碱（phosphorylcholine，PC）、磷酸胆碱、脯氨酸-甜菜碱（Proline betaine）、双羟基十八碳烯酸（DiHOME）有显著性降低，经过游泳训练后，运动干预组（2周、4周、8周）大鼠体内的这些物质均有明显上调，上调程度的先后顺序有所不同，但EPA、LA是三个时点中上调显著的共同物质，其它如脯氨酸-甜菜碱、磷酸胆碱均有不同程度地上调。

相比于正常对照组大鼠，模型组大鼠体内的精氨酸（arginine，Arg）、肉毒碱（carnitine）、单甘油酸酯（monoglyceride，MG）、磷酸胆碱（phosphatidylethanol amines，PE）、丙酰肉毒碱 （propionyl-L-carnitine，PLC）、1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，SPP）、葡糖酸（gluconic acid）、核糖酸（ribonic acid）有显著性升高，经过游泳训练后，运动干预组（2周、4周、8周）大鼠体内的这些物质均有明显下调，下调程度的先后顺序有所不同，但MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP是三个时点中下调显著的共同物质，其它如肉毒碱、PE、葡糖酸均有不同程度地下调。

Tab.3 Fifteen significant differencemetabolites in group DE4 based on fold-change

3 讨论

EPA是多不饱和脂肪酸ω-3系列中常见的一种。ω-3系脂肪酸已被证实能促进循环系统的健康和防止胆固醇及脂肪在动脉壁上积聚。EPA对肾病、2型糖尿病等的治疗起到积极的作用。LA是大鼠体内的必需脂肪酸，能降低血液胆固醇，预防动脉粥样硬化。研究发现，如果缺乏LA，胆固醇就会与一些饱和脂肪酸结合，发生代谢障碍［16］。

1-磷酸鞘氨醇（SPP）是鞘磷脂代谢更新过程中的代谢产物之一。近年来发现SPP在细胞增殖、移动、心血管系统、免疫系统方面有重要作用［17］。葡糖酸是在6-磷酸葡萄糖转变为6-磷酸葡糖酸内酯的过程中形成的，然后进入磷酸戊糖循环途径，其产物与糖酵解途径存在交叉。模型组大鼠体内的MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP显著性升高，运动干预组大鼠体内的这些物质均有明显下调，且MG、葡糖酸、PLC、Arg、SPP是三个时点中下调显著的共同物质，其它如肉毒碱、磷酸胆碱均有不同程度的下调。这些下调的物质分别与甘油三酯代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢、葡萄糖代谢、氨基酸代谢以及胆碱代谢相关。

模型组大鼠体内EPA、LA的显著性降低，而MG、PLC的显著性升高，表明模型组大鼠体内脂类代谢出现紊乱。推测糖尿病大鼠体内最先被动员的能量储备是甘油三酯，脂肪动员加速，大鼠消瘦明显，2周运动刺激加速了这种代谢紊乱（与肝功能低下有关）。代谢组学检测分析结果可见，2周干预时点MG的变化倍数最为明显。而为尽可能动员脂肪，提高脂肪酸利用率，导致肉毒碱含量较对照组增加，以及随后的脂肪酸含量的降低，运动干预可以上调EPA、LA含量接近正常水平，尤其以4～8周效果显著。模型组大鼠体内葡糖酸的显著性升高，表明模型组大鼠体内磷酸戊糖代谢和糖酵解代谢加速，且4周干预时点葡糖酸的变化倍数最为明显。磷酸胆碱可参与磷脂的合成，加速甲基转移，供应活化甲基，加速肝细胞再生，具有保肝、强肝、解毒、促进脂质代谢和抗脂肪肝的作用［18］。模型组大鼠体内磷酸胆碱有不同程度的降低和升高，表明糖尿病大鼠体内胆碱代谢紊乱。运动干预2～4周一定程度上加速了组织受损 ，8周时点出现较明显的改善，总体上对肝肾功能有一定促进作用，这与李国立的研究结果一致［19］。

综上所述，我们应用UPLC/Q-TOFMS技术检测鉴定，并依据变化倍数大小排列组合，形成运动干预三个时点的生物标记物组合（每个组合15个物质）。这些不同时点特异的血清生物标记物组合中，大部分代谢物在不同时点同时出现，但变化倍数上有明显差异。经检索这些生物标记物分别与甘油三酯代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢、葡萄糖代谢、氨基酸代谢以及胆碱代谢相关。

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Metabolom ics analysis on serum biomarkers tim ing characteristics of type 2 diabetic rats intervened by exercise

LILei1△，JINQi-guan2，HU Zhen-dong1，XUE Peng1
（1.Departmentof Physical Education，Huaibei Normal University，Huaibei 235000；2.Department of Physical Education，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

【ABSTRACT】Objective:To analyze the combined featuresof serum biomarkerof exercise-intervened type 2 diabetesmellitus（T2DM）rats at different time point.Methods:Ninety SD rats randomly selected from 100were fedwith high glucose and fatdiet for 4weeks，and then received intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ）according to 40mg/kg by weight；aftermodeling for oneweek，Seventy-one ratswere successfullymodeled amongwhich intervenedwith swimming at three different time points（2w，4w and 8w）.Eighty-one ratswere finally divided into 8 groups as below:Normal control group（C0，n=10）；DM model comparison group（DC0，n=10）；DM model comparison 2w group（DC2，n=11）；DM model comparison 4w group（DC4，n=10）；DM model comparison 8w group（DC8，n=9）；DM exercise intervention 2w group（DE2，n=11）；DM exercise intervention 4w group（DE4，n=10）；DM exercise intervention 8w group（DE8，n=11）. The UPLC/Q-TOFMS techniquewas used to conductmetabonomics testof serum of rats to analyze the combined features of serum biomarkers under exercise intervention at different time points.Results:According to fold change，we got the biomarker combinations（with 15 specific substances in each combination）of exercise intervention at three time points.In these serum biomarker combinations thatwere specific atdifferent time points，amajority ofmetabolites appeared simultaneously at different time points butwith obvious difference of fold change.Fold change ofmonoglyceride（24∶6）and gluconic acidweremostevident respectively at 2w and 4w intervention time points，Eicosapentaenoic Acid （EPA）andlinolenic acid（LA）contentsmightapproach the normal levelat4～8 time point.Conclusion:Combined featuresof serum biomarker of exercise-intervened T2DM rats are specific at different time point.Both EPA and LA are common substances significantly up-regulated while MonoglycerideMG（24:6），Gluconic acid，Propionyl-L-carnitine（PLC），Arginine（Arg）and Sphingosine-1-phosphate（SPP）are common substances significantly down-regulated at three time points.

exercise intervention； different time point； T2DM； rats； biomarker

R73-3

A

1000-6834（2016）03-255-05

国家体育总局全民健身研究领域课题（2015B056）；安徽省高校优秀青年人才基金重点项目（2013SQRL032ZD）；淮北市科技人才培育计划（20140304）

2015-10-20

2016-02-01

Tel:13909615572；E-mail:Lisulei73@aliyun.com