性腺激素水平的尿样测定

2016-09-12李晓楠川北医学院教务处四川南充637100

系统医学 2016年8期

李晓楠川北医学院教务处，四川南充　637100

性腺激素水平的尿样测定

李晓楠
川北医学院教务处，四川南充637100

性腺激素是生殖内分泌系统重要的生理指标之一，其测定样品和技术对科学研究及临床实践至关重要。此文介绍了尿液作为测定性腺激素样品的优越性及可行性，并分析了常用的尿样测定关键方法技术，以期为尿样性腺激素测定技术发展提供科学依据，同时作为非损伤性研究的重要补充。

尿液，性腺激素，激素测定

［Abstract］Gonadal hormone is one of the important physiological indexes of reproductive endocrine system.Sample and technology are crucial for scientific research and clinical practice.This paper introduces the superiority and feasibility of gonadal hormone assay with urine samples，and analyzes its key measurement techniques，hoping to provide scientific basis for the development of gonadal hormone measurement and become an important supplement to the nondamage research.

［Key wordst］Urine；Gonadal hormone；Hormone assay

人类生殖功能和动物繁殖行为的外在表现均依赖于体内生殖激素的调控，生殖激素的调控作用受到机体内分泌系统的调节，其中最为重要的是下丘脑-垂体-性腺轴，而该轴主要的生殖调控功能是通过性腺分泌的性腺激素来实现的。性腺激素主要包括三种，即雄激素、雌激素和孕激素，三者均为甾体类激素，是调节动物和人类生殖行为最重要的性腺激素。因此，研究这三种性腺激素的分泌水平是研究动物生殖功能及其行为的重要内容，同时也是临床中治疗生殖障碍的重要监测手段之一。此文总结分析性腺激素尿样测定的可行性及样本优势，同时对常用的尿样前处理方式及测定技术进行综述，以期为尿样性腺激素测定技术发展提供科学依据，同时作为非损伤性研究的重要补充。

1　尿样测定性腺激素的优越性及可行性分析

性腺激素主要通过血液发生调节作用，因此大多研究都以血样作为首选。但是随着动物研究的广泛性和生殖类激素的广泛使用，尿液也成为重要的研究样本。首先，在动物研究中需要采集大量连续血样标本时，由于频繁采血，对动物的伤害性极大。特别是对于小型、敏感型动物，采血活动是外界对研究动物的应激源，会对动物产生心理及生理影响，甚至会影响到研究结果。再者，对于珍稀濒危动物，生殖周期研究较少，无全周期激素动态测定，饲养繁殖相对困难，在无参考的情况下频繁利用血样检测性腺激素水平无疑是对这些动物的重大刺激，甚至会造成动物的死亡。第三，如果研究对象是野生动物，采集血样更为不易，如何利用激素水平测定监控野生动物的生殖状况是很多研究学者面临的又一个难题。综合以上原因，血样已不再是性腺激素水平测定的首要选择，加之生殖激素的高效性，机体内源性腺激素浓度低，干扰大，对激素检测技术要求较高，因此动物尿样、粪样成为性腺激素检测的重要样本来源。

在性腺激素测定方面，相比较粪样标本，尿样有更多优势。粪便中成分复杂，多含有食物纤维，对样品的前期处理更为复杂［1］。另外，性腺激素及其代谢产物在粪便和尿液中出现分泌峰的时间相差甚远。在非人灵长类动物中的研究显示，将3H标记的性腺激素注入狒狒体内后，性腺激素在粪样和尿样中的分泌峰分别比血样滞后36.4和4.5 h［2］。这就说明粪样采集更耗时，等待采集样品期间不可控因素增多，可能给检测带来更大误差，而尿样检测耗时较短，更利于研究工作。

尿液之所以可以成为性腺激素水平测定的样本是因为尿液中的性腺激素浓度与血液中性腺激素浓度呈正相关。性腺激素在血液中发挥其生物学功能的时间很短，一般只有几分钟，最后都在肝脏内灭活。激素灭活即是将血液中的性腺激素经过降解和清除，使血液中的激素活性降低。激素灭活的过程主要包括对激素依次进行的羟化、硫酸酯化或者糖醛酸结合成钝化形式等代谢过程，随后经排泄物排出体外。研究显示，注射放射性雌二醇后，尿中可回收65%，其中20%为雌二醇，其余为雌二醇的代谢产物［3］。因此，尿液作为性腺激素的检测样本是可行的，同时为非损伤研究方法作了重要补充。

2　尿样前处理技术

在性腺激素测定之前，对尿样进行前期处理能够保证测定结果的精准性。尿样前处理是经过不同方式的分离纯化、有机溶剂抽提分离、甚至层析、萃取等方式去除尿样中的干扰物质，提高待测物质的测定准确性。于小杰等总结分析了大熊猫尿液类固醇激素测定的前处理方式，提出不同的尿样处理方式会影响所测定的性腺激素的含量值，而且不同处理方式所得出的研究结果间并无可比性［4］。目前，对于尿液激素测定的前处理并无统一认可的技术，因此比较不同处理方式并遴选出最优方式是尿样性腺激素测定的关键。

尿液作为性腺激素的测定样本尚不广泛，主要的尿样前处理方法基于有机溶剂提取、层析及萃取技术原理，常用的有机溶剂为乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等。在所有前处理方法中，首先需要对尿样进行酶解，促使结合态的性腺激素及其代谢物由结合态转化为游离态，常用的酶解溶剂为葡萄糖醛酸脱氢酶。有学者认为单纯的有机溶剂抽提并不能完全将干扰物质分离出去，因此在有机溶剂抽提的基础上加上不同层析纯化技术，提高了测定的准确性［5］。有研究显示，尿样标本冷冻解冻后再离心经固相萃取柱萃取，提取回收率可达到90%以上，去除尿液标本中硫酸盐和磷酸盐等杂质，成功检测尿液中多种内源性类固醇激素［6］。因此，不同的前处理方法对性腺激素的测定具有重大影响，选取合理的纯化溶液尤为重要，多种前处理方法的联合使用可能会提高尿样的前处理效果。

3　尿样性腺激素测定技术

在川金丝猴的研究中，作者利用酶联免疫吸附测定法，购买商用酶免试剂盒成功检测出川金丝猴尿液中雌二醇、孕酮和睾酮的含量［7］。放射免疫法是以放射性核素为标记的免疫分析技术，常用于临床血样检测，是目前最常用的尿样激素检测技术。但有研究显示，因尿液中的雌激素及其代谢物的结构很相似，以免疫学为原理的各种技术不能同时检测雌激素和代谢物，只适用于检测激素总体水平［8］。除此之外，Access化学发光仪也被应用于人类尿液睾酮含量的测定，结果显示Access化学发光仪可用于测定尿液睾酮，但须与血清同时进行测定结果更具参考价值［9］。近些年来，在生物检测中，质谱联合色谱技术因为其超灵敏性而被广泛应用。色谱-质谱联用检测技术随着该技术的发展需要，主要有以下几种：GC/MC（气相色谱质谱联用）、HPLC/MS（高效液相色谱质谱联用）、GC/MS/MS、HPLC/MS/MS［10］。这些技术同时应用于奥运会运动员的尿样兴奋剂的检测中［11］。色谱质谱联用技术对上样样品要求较高，一般需要复杂的前处理步骤［12］。目前有固相萃取、分散液液微萃取、浊点萃取、盐析辅助液液萃取等多种方法。

综上可知，目前动物尿样性腺激素常用的测定技术主要有酶联免疫法、放射免疫法、高效气相色谱联合质谱和高效液相色谱联合质谱技术。针对不同物种和不同采集、保存及前处理的尿液样本，如何正确选取测定技术是研究工作和临床实践的关键。因此，作者对以上几种常用尿样性腺激素技术的优缺点进行了比较分析，统计分析结果见表1。虽然放射免疫法具有辐射污染，测定结果不易自动分析，但是该方法适合于少量样本测定，对于取样困难的研究，此方法有明显的优势。在实际测定过程中可以通过规范操作步骤，试剂盒现用现购等方式将辐射降低至最低。相比较而言，酶联免疫法对工作人员的安全性更高，可以批量样本测定，但是因为本方法干扰性大，因此对抗体的灵敏度有较高要求。高效气相（液相）色谱联合质谱技术具有前两种检测方法的诸多优点，例如灵敏度高，检测准确度更高，对人身健康无危害，但是因该技术需要的仪器设备更加精密，操作更加复杂，对操作人员的技术要求更高，同时测定更耗时，且不能批量检测。因此，在实际研究工作中，合理选取激素检测方法时应基于不同技术的优势和劣势。为了降低测定误差，今后可以加强技术研究，尽量克服其缺点，促进这些测定技术的广泛应用。

表1　性腺激素水平测定技术优缺点对比

无论哪一种性腺激素检测方法，为了避免尿液水分含量差异影响尿液中激素浓度，通过测定尿液肌酐（Creatinine，Cr）值进行修正已经是一种常用且成熟的方法。将激素浓度表示方法换算为每毫克肌酐中激素含量，即ng激素/mg肌酐（ng/mg Cr）。最常用的测定尿液肌酐的方法为苦味酸法，其测定原理是肌酐在强碱中与苦味酸作用产物为橙黄色，通过分光光度计即可测定吸光值［13］。

4　总结与展望

综上所述，尿液中性腺激素及其代谢产物含量与血液中呈现正相关，因此尿液具有成为性腺激素含量测定样品的生理基础。同时性腺激素尿样检测作为一种非损伤研究方法，不仅减少了对机体的刺激应激，同时更加适用于连续大量采样、生殖周期动态监测等研究工作中，具有血样不可比拟的优势。目前已有有机溶剂提取、层析、萃取等多种尿液前处理方法和酶联免疫法、放射免疫发、色谱、质谱等多种尿样性腺激素检测技术，但是尿样前处理技术不够成熟，多种前处理方式所得结果并无可比性，检测技术精准度有待提高。

基于以上尿样性腺激素测定的研究现状，该领域的深入研究可以从以下几个方面进行。首先，深入研究尿液代谢规律，分析尿样中性腺激素及其各级代谢产物出现的时间及比例，有助于提高检测分析的准确性。其次，在尿样的前处理方式上，采用合理的纯化溶剂及多种技术联用都将提高尿样的纯化效果，提高尿液前处理技术，为提高检测精准度提供基础。最后，尿样前处理技术统一化，增加不同物种、不同研究间结果的可比性研究，更好促进性腺激素尿样检测技术的发展和广泛应用。

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Urine Assay of Gonadal Hormone Levels

LI Xiao-nan
North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan Province，637100 China