HSPA12A高表达于神经组织

桂亚利　毛雨　孔秋月　张小进　刘莉　丁正年



HSPA12A高表达于神经组织

桂亚利毛雨孔秋月张小进刘莉丁正年

目的研究热休克蛋白70(HSP70)家族新成员HSPA12A的组织分布和细胞定位。方法采用免疫印迹和免疫荧光组织化学方法,分析成年小鼠7种不同组织中HSPA12A的表达，并探讨其是否在成年、胚胎鼠神经元中具有表达。结果(1) 在成年小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、骨骼肌这7种组织中,脑组织的表达量是其他组织的至少10倍以上(P<0.01);(2) HSPA12A在胚胎时期的鼠皮层神经元中表达;(3)HSPA12A在成年鼠的皮层神经元中持续表达。结论HSPA12A 被首次证实在神经组织中表达最高,且从胚胎时期到成年鼠皮层神经元中均持续表达,提示HSPA12A可能在神经细胞的内稳态维持中具有重要作用。

HSPA12A; 脑; 神经元

热休克蛋白(HSP)是一个进化过程中高度保守的多基因超家族,因在热应激的果蝇体内首先发现而得名。迄今为止,已经发现并鉴定出数十种热休克蛋白,根据其分子量大小,分为如下几个家族[1]:小分子HSP家族(HSPB),HSP70家族(HSPA),大分子HSP家族(HSPH),以及 DNAJ家族。在这些已经发现的HSP中,针对HSP70家族成员的研究最为广泛和深入。

研究发现,HSP70家族在体内的几乎所有组织器官都有分布。2003年,Han等在主动脉粥样斑块中克隆到2个新型HSP,分别命名为HSPA12A和HSPA12B,因其含有HSP70家族的特定结构域而归纳到HSP70家族。我们前期研究发现,HSPA12B完全不同于HSP70家族的其他成员广泛表达的特征,而是特异性地表达于血管内皮细胞，并参与血管相关的病理生理事件[2-5]。然而,对于HSPA12A的生物学特性、生物学功能的认识尚处于空白状态。

本研究采用小鼠和体外培养的原代神经元模型,用免疫印迹和免疫荧光组织化学法分析了HSPA12A在小鼠体内不同组织和细胞中的分布状况和特点,以期为进一步探索HSPA12A的功能奠定基础。

1　材料和方法

1.1实验动物3只8周龄SPF级近交系C57/BL6小鼠,购买自南京大学模式动物研究所。

1.2组织收集小鼠戊巴比妥麻醉后,仰卧在手术台上,分别游离和收集心脏、肝、肺、肾、脾、脑、骨骼肌等7种组织,液氮速冻后,-80 ℃保存。

1.3胚胎大鼠皮层神经元分离和培养孕18 d鼠麻醉、取胎鼠,分离其皮层组织,剪成1 mm 3小块,经0.25%胰蛋白酶消化15 min后,玻璃滴管吹打、400目滤网过滤、1000 r/min离心4 min,重悬细胞到培养皿中进行神经元无血清培养。

1.4免疫印迹方法组织或细胞在蛋白裂解液中裂解后,10 000 r/min离心20 min,收集上清,BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行10%SDS-PAGE蛋白质分离,转膜后,5%牛奶封闭1 h, 抗HSPA12A抗体4 ℃孵育过夜,然后HRP标记的二抗孵育1 h, ECL反应后,化学发光仪发光显色。同一批蛋白的抗α-Tubulin免疫印迹作为蛋白质上样的内参照。

1.5免疫荧光组织化学小鼠麻醉,取脑组织,4%多聚甲醛4 ℃固定过夜,30%蔗糖浸泡至组织块下沉。接着OCT包埋,切成4 μm冰冻切片,2.5%正常羊血清封闭30 min,0.1%Triton×100处理15 min,与兔抗HSPA12A(1∶200)和鼠抗NeuN(1∶200)抗体同时孵育过夜(4 ℃),彻底清洗后,再将切片与FITC标记的抗兔IgG、CY3-标记的抗鼠IgG反应1 h,荧光油封片,荧光显微镜(奥林巴斯,日本)下观察,放大倍数为400倍。

2　结果

2.1HSPA12A蛋白在脑组织表达最高在所检测的7种组织中,HSPA12A在脑组织中表达最高。脑组织HSPA12A蛋白水平分别是脾的17.8倍,肺的31.2倍,肾的10.1倍 (P<0.01)。见图1。

图1　HSPA12A在小鼠不同组织中的差异性表达(n=3)

2.2HSPA12A蛋白在大脑皮层神经元中表达在成年鼠的脑组织冰冻切片上进行抗HSPA12A以及神经元标志物NeuN的免疫荧光组织化学分析后发现,在小鼠大脑皮层中,HSPA12A蛋白出现在NeuN染色阳性的细胞中,提示HSPA12A表达于成年鼠大脑皮层的神经元中(图2)。

图2　HSPA12A在成年小鼠大脑皮层神经元中的表达(n=3)

2.3HSPA12A在胚胎大鼠原代海马神经元中表达我们进一步研究HSPA12A是否在胚胎时期的大脑皮层神经元就有表达。为此,我们分离并培养了孕18 d大鼠的胎鼠皮层神经元,并在培养5 d时收集细胞,采用免疫印迹分析其中HSPA12A表达情况,抗α-Tubulin免疫印迹作为内参照。结果显示,HSPA12A确实在胚胎大鼠的皮层神经元中即有表达(图3)。

图3　HSPA12A在胚胎鼠大脑皮层神经元中的表达

3　讨论

本研究首次证实HSPA12A在脑组织中表达最高,在胚胎鼠和成年鼠的大脑神经元中均有表达,这种从胚胎时期就开始的、在神经组织偏好性的表达提示，HSPA12A可能在神经元内稳态维持中具有十分重要的意义。

HSPA12A是新发现的HSP70家族成员。HSP70家族包括[1]:HSPA1A, HSPA1B, HSPA1L,HSPA2,HSPA5,HSPA6,HSPA7,HSPA8,HSPA9,HSPA13,HSPA14,以及2003年克隆到的HSPA12A和HSPA12B。除HSPA12A和HSPA12B以外,其他HSP70成员呈现为广泛性表达、无显著组织偏好性,它们通过抗氧化应激、 激活抗凋亡信号抑制细胞凋亡,从而对心、脑等重要脏器的缺血性损伤具有显著保护作用。因此,HSP70家族在维持机体正常生理活动中具有重要作用。

2003年Han等首次在人类和小鼠主动脉粥样斑块中,同时克隆到HSPA12A和HSPA12B这2个基因。然而,与此前发现的HSP70成员不同的是,HSPA12B被首先证实特异性表达于血管内皮细胞,并参与血管相关的病理生理过程。例如,斑马鱼HSPA12B基因敲除后,其脉管系统数量减少、直径变细,从而导致斑马鱼的发育迟缓和体型缩小。我们课题组的前期研究也显示,HSPA12B在血管内皮细胞高表达后,可以通过抑制血脑屏障通透性、激活Akt等机制,抑制脑缺血再灌注损伤,并激活eNOS依赖性血管新生信号、促进侧支循环建立,从而改善心肌梗死后的心功能不全和心肌重塑[2-7]。这些结果提示,HSPA12B的血管内皮细胞特异性表达与其生物学功能是密切联系的。

与HSPA12B同时且在同一组织中发现的,还有HSPA12A。迄今为止,有关HSPA12A的唯一报道,是在精神病患者的大脑皮层中发现HSPA12A表达较正常人显著降低,但关于HSPA12A的组织分布和生物学功能几乎处于空白状态。本研究中,我们采用免疫印迹、免疫组织化学分析手段,首次证实HSPA12A从胚胎后期至成年阶段的大鼠或小鼠的皮层神经元中都持续表达,且在脑组织中的表达最为丰富,是其他组织表达量的十倍、甚至几十倍。这些结果提示了HSPA12A可能通过维持神经元内稳态,从而在神经系统的发育以及出生后神经系统的功能中具有非常重要的作用。我们将在后续研究中探索病理状态下(如情绪应激、脑缺血等),HSPA12A的表达变化及其生物学意义,为相关疾病的防治新靶点的发现和鉴定奠定基础。

[1]Vos MJ, Hageman J, Carra S, et al. Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families[J]. Biochemistry,2008, 47(27): 7001-7011.

[2]Li J, Zhang Y, Li C, et al. HSPA12B attenuates cardiac dysfunction and remodelling after myocardial infarction through an eNOS-dependent mechanism[J]. Cardiovasc Res,2013, 99(4): 674-684.

[3]Ma H, Lu T, Zhang X, et al. HSPA12B: a novel facilitator of lung tumor growth[J]. Oncotarget,2015,6(12): 9924-9936.

[4]Ma Y, Lu C, Li C, et al. Overexpression of HSPA12B protects against cerebral ischemia/reperfusion injury via a PI3K/Akt-dependent mechanism[J]. Biochim Biophys Acta,2013, 1832(1): 57-66.

[5]Wu J, Li X, Huang L, et al. HSPA12B inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory response in human umbilical vein endothelial cells[J]. J Cell Mol Med,2015, 19(3): 544-554.

[6]Zhou H, Qian J, Li C, et al. Attenuation of cardiac dysfunction by HSPA12B in endotoxin-induced sepsis in mice through a PI3K-dependent mechanism[J]. Cardiovasc Res,2011, 89(1): 109-118.

[7]Shevtsov MA, Nikolaev BP, Yakovleva LY, et al. Neurotherapeutic activity of the recombinant heat shock protein Hsp70 in a model of focal cerebral ischemia in rats[J]. Drug Des Devel Ther,2014, 8: 639-650.

Expression of HSPA12A as a novel member of HSP70 family in brain and neurons

GUIYa-li,KONGQiu-yue,DINGZheng-nian.DepartmentofAnesthesiology;MAOYu,ZAHNGXiao-jin,LIULi.

DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China

ObjectiveTo investigate the expression profile of HSPA12A in mammalian.MethodsImmunoblotting and immunofluorescence analysis were used to examine the protein abundance of HSPA12A in 7 types of tissue in murine and to analyze whether HSPA12A was expressed in fetal and adult cortex neurons.Results(1) HSPA12A expression was most abundant in brain, which was more than 10-fold than other tissue (P<0.01); (2) HSPA12A was expressed in fatal cortex neurons; (3) HSPA12A was expressed in adult cortex neurons.ConclusionsHSPA12A is preferably expressed in brain and exists in fetal and adult cortex neurons. The brains-preferred expression pattern suggests that HSPA12A may play an important role in the maintenance of cerebral homeostasis.

HSPA12A; brain; neuron

国家自然科学基金项目(81571290)

210029江苏省南京市，南京医科大学第一附属医院麻醉科(桂亚利， 孔秋月，丁正年)；老年医学科(毛雨，张小进， 刘莉)

丁正年，Email: zhengnianding@njmu.edu.cn

R 338

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.08.015

2016-04-20)