Nrf2/ARE通路相关因子在脂肪变性HepG2细胞中的表达及其意义*

张玉佩， 孔怡琳， 杨钦河△， 金　玲， 梁荫基， 何毅芳， 邓远军， 李媛媛， 王观龙， 程少冰

(1. 暨南大学医学院中医系， 广东广州 510632； 2. 广东省中医院大学城院区放疗科， 广州 510006；3. 暨南大学第一附属医院中医科， 广东广州 510632)



Nrf2/ARE通路相关因子在脂肪变性HepG2细胞中的表达及其意义*

张玉佩1， 孔怡琳2， 杨钦河1△， 金玲3， 梁荫基1， 何毅芳1， 邓远军1， 李媛媛1， 王观龙1， 程少冰1

(1. 暨南大学医学院中医系， 广东广州 510632； 2. 广东省中医院大学城院区放疗科， 广州 510006；3. 暨南大学第一附属医院中医科， 广东广州 510632)

目的：探讨建立一种新型的脂肪变性人肝癌细胞(HepG2)模型，观察核因子E2相关因子2 (Nrf2)/抗氧化反应元件 (ARE)通路相关因子在脂肪变性HepG2细胞中的表达及其意义。方法：HepG2细胞给予含25%的胎牛血清、0.1%医用脂肪乳和0.1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)的DMEM培养基分阶段诱导后，建立脂肪变性HepG2细胞模型，并设置对照组。模型成功后，以油红O染色观察细胞内脂滴形成状况，并用全自动生化仪检测细胞内甘油三酯(TG)含量；采用流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)的含量，采用生物试剂盒检测细胞内一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量及活性的变化；运用Western blot法检测各组细胞Nrf2、血红素氧化酶-1(HO-1)和醌氧化还原酶1 (NQO1)蛋白的表达。结果：与对照组比较，模型组油红O染色可见细胞内橘红色脂滴大量形成，TG、ROS、NO、MDA含量水平明显增高(P<0.05，P<0.01)，SOD、GSH-Px活性明显下降(P<0.01)，Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达均显著增高(P<0.05，P<0.01)。结论：本模型可以成功诱导HepG2细胞发生脂肪变性和氧化应激损伤状态；Nrf2/ARE通路下游相关因子发生激活可能与脂肪变性HepG2细胞氧化应激的过度反应有关。

HepG2细胞；脂肪变性；Nrf2/ARE通路；氧化应激

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种肝细胞的脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征，其发病包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝硬化，晚期甚至可发展为肝癌。NAFLD的发病机制尚未完全明确，其发病非单一因素引起，与体重超标(特别是中心性肥胖)、胰岛素抵抗、氧化应激、葡萄糖不耐受(2型糖尿病)、血脂障碍、高血压和其它的一些代谢症候群等密切相关[1-3]，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的过度释放和氧化应激引起的细胞损伤在NAFLD的发病机制中具有举足轻重的作用[4]，而核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件 (antioxidative response element，ARE)通路在细胞抗氧化应激和外源性有毒物质诱导的主要防御机制中发挥主导作用，是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路[5-7]。体外脂肪变性细胞模型是研究NAFLD发病机制的重要载体，人HepG2肝癌细胞株与肝细胞相比，生物学功能相似，但其对脂毒性的耐受能力更强，是国内外诱导脂变模型使用最多的细胞[8,9]。本研究采用胎牛血清、医用脂肪乳和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)分阶段和分时相诱导的方法成功建立了一种新型的脂肪变性HepG2细胞模型，观察Nrf2/ARE通路相关因子在脂肪变性HepG2细胞中的表达，综合评价细胞脂质蓄积与氧化应激损伤之间的关系。

1　材料与方法

1.1材料

人HepG2肝癌细胞株由暨南大学医学院生化教研室馈赠；胎牛血清、DMEM高糖培养基和0.25%胰蛋白酶购自美国hyclone公司；油酸(oleic acid，OA)、棕榈酸(palmitic acid，PA)和无游离脂肪酸牛血清白蛋白(FFA-free Bovine Serum Albumin, FFA-free BSA)购自美国Sigma公司； CCK8细胞活力试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所；中/长链脂肪乳注射液购自华瑞制药有限公司；油红O染色试剂盒、ROS、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonyldialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Nrf2、醌氧化还原酶1 (NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1，NQO1)蛋白抗体购自英国Abcam公司，血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)蛋白抗体购自美国Abgent公司，内参照GAPDH蛋白抗体购自美国CST公司。日本日立公司全自动生化分析仪，日本OLYMPUS荧光倒置显微镜，宁波新芝生物科技股份有限公司JY96-Ⅱ超声细胞粉碎机，奥地利TECAN公司Tecan-safire2全波长多功能酶标仪，美国BD FACSAriaTM Cell Sorter 流式细胞仪。

1.2方法

1.2.1HepG2细胞培养HepG2细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养条件为37℃，CO2浓度为5%。根据细胞生长情况，每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞并传代，实验中设置对照组和模型组，分别于6孔板中培养，每组设6孔观察。1.2.2第一诱导液作用浓度的确定将处于对数生长期的HepG2细胞按照1×104cells/well接种于96孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁48 h后，胎牛血清诱导浓度设置为15%、25%、35%、45%、55%；医用脂肪乳诱导浓度设置为0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%，将不同浓度胎牛血清和中/长链脂肪乳交叉组合，设置不同浓度组合的第一诱导液，诱导细胞12 h，对照组给予无血清DMEM培养基，用CCK8比色法观察细胞增殖情况(以吸光度OD值表示)，最终确定25%胎牛血清和 0.1%中/长链脂肪乳DMEM培养基为最佳作用浓度组合。1.2.3第二诱导液作用浓度的确定FFA的制备：参考Gómez Lechón[8]FFA制备方法并进行改进，将终浓度为2 mmol/L的OA和PA以2∶1的比例混合，配制成储液(OP液),再将脂肪酸储液与FFA-free BSA混合，配制成结合BSA的脂肪酸，有利于细胞的摄取。FFA作用浓度的确定：将处于对数生长期的HepG2细胞按照1×104cells/well接种于96孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁48 h后，采用25%的胎牛血清和0.1%的医用脂肪乳DMEM培养基诱导细胞12 h后，各孔更换为不同浓度的FFA诱导液(0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L)，对照组更换为1% FFA-free BSA无血清DMEM培养基，诱导细胞12 h，用CCK8比色法观察细胞增殖情况(以吸光度OD值表示)，最终确定含0.1 mmol/L的FFA无血清DMEM培养基为第二诱导液最佳作用浓度。

1.2.4HepG2细胞脂肪变性模型的建立和鉴定将处于对数生长期的HepG2细胞接种于6孔培养板爬片中，在37℃、5%CO2培养箱中孵育贴壁48 h后，更换新鲜培养液，采用第一诱导液(即25%的胎牛血清+0.1%的中/长链脂肪乳DMEM培养基)诱导细胞12 h，然后去除第一诱导液，更换为第二诱导液(即含0.1 mmol/L的FFA无血清DMEM培养基)诱导细胞12 h。对照组予不含血清的DMEM培养基培养24 h，其中前12 h予无血清的DMEM培养基，后12 h予含1%FFA-free BSA无血清DMEM培养基。模型诱导24 h后，吸弃培养孔中的培养基，用PBS洗涤3遍，将6孔板中的细胞爬片用4%多聚甲醛固定10 min，油红O染液闭光染色20 min，60%异丙醇冲洗30 s，蒸馏水洗30 s至背景透明，OTC明胶封片，放置于显微镜下，采用Leica Qwin plus系统(普通光)拍照，观察细胞内脂滴的变化。

1.2.5细胞内甘油三酯含量的测定取完各孔细胞上清后，将细胞用PBS洗涤2遍，加入0.25%胰酶消化细胞，用含10%胎牛血清DMEM培养基终止消化，并吹打细胞(确保将各孔内的所有细胞吹下)，将各孔中的细胞悬液分别移入1.5 ml EP管中，离心(4℃, 1 000 r/min, 5 min)，弃上清；PBS洗涤细胞2遍，离心(4℃, 1 000 r/min, 5 min)，弃上清；将EP管置于冰上，每管各加入异丙醇300 μl；用超声细胞粉碎机裂解细胞3 min；裂解后，离心(4℃，3 000 r/min，5 min)，取上清，全自动生化仪检测上清中甘油三酯(triglyceride，TG)含量。

1.2.6流式细胞术检测细胞ROS的含量采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS含量，细胞诱导成功后，经洗涤、消化，收集对照组和模型组的细胞，无血清DMEM培养基重悬，离心(4℃, 1 000 r/min, 5 min)，弃上清，每管加入10 μmol/L的DCFH-DA染液200 μl，37℃避光孵育20 min，无血清DMEM培养基洗涤2次，离心(4℃, 1 000 r/min, 5 min)，弃上清，加入200 μl无血清培养基，混匀，在流式细胞仪上检测，分析细胞ROS平均荧光强度值(mean intensity of fluorescence，MIF)。

1.2.7生物试剂盒检测细胞内SOD、NO、MDA和GSH-Px的活性和含量按1.2.5方法处理细胞，取细胞裂解液，采用细胞MDA测定试剂盒(硫代巴比妥酸法)、NO测定试剂盒(硝酸盐法)、SOD测定试剂盒(水溶性四唑盐法)和GSH-Px测定试剂盒(DTNB法)测定细胞内SOD、NO、MDA和GSH-Px活性和含量。

1.2.8Western blot法检测细胞Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平取适量裂解液，使用前先加入PMSF，使PMSF终浓度为1 mmol/L。计数细胞，按照每6×106个细胞加入1 ml RIPA裂解液，4℃，12 000 r/min×离心5 min，根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。HepG2细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、4℃过夜。洗涤后加入二抗，孵育，充分洗涤，然后进行化学发光、曝光、 显影、 定影 ，最后对结果进行光密度扫描分析。

1.3统计学处理

2　结果

2.1油红O染色观察细胞内脂滴变化情况

对照组：细胞体积较小，细胞边缘清晰，大部分细胞无明显橘红色脂滴蓄积，仅有少数细胞内有少量橘红色脂滴，颜色较淡；模型组：细胞明显肿大，胞膜轮廓模糊，细胞内可见较多橘红色脂滴，并出现脂滴融合现象，部分脂滴甚至融合成链状或环状(图1)。

Fig. 1Lipid droplets were observed by oil red O staining(bar=100 μm)

2.2细胞内TG含量的变化

与正常组比较，模型组HepG2细胞内TG含量明显增高(P<0.01)，提示诱导脂肪变性以后的HepG2细胞有大量脂肪在细胞内蓄积(表1)。

2.3细胞ROS的测定结果

对照组MIF为2661.0±403.1，模型组MIF为8453±480.6，与对照组比较，模型组细胞ROS含量明显增加，峰值出现有意义的向右移动，差异具有显著性意义(P<0.01，图2)

Fig. 2Changes of intracellular ROS level

2.4细胞内SOD、NO、MDA、GSH-Px的含量

与正常组比较，模型组NO、MDA含量水平明显增高(P<0.05，P<0.01)，SOD、GSH-Px活性水平明显下降(P<0.01，表1)。

2.5细胞Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平

与正常组比较，模型组Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01，图3，表2)

Tab.

TG: Triglyceride; SOD: Superoxide dismutase; NO: Nitric oxide; MDA: Malonyldialdehyde; GSH-Px: Glutathione peroxidase

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Fig. 3Expression of Nrf2、HO-1 and NQO1 protein in HepG2 cells from each group

Nrf2: Nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase-1; NQO1: NAD(P)H: Quinone oxidoreductase-1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase； C: Control; M: Model

GroupNrf2/GAPDHHO-1/GAPDHNQO1/GAPDHCon-trol0.0273±0.00570.1480±0.50100.0370±0.0540Model0.6025±0.0900*0.3326±0.0906**0.4821±0.1116*

Nrf2: Nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2; HO-1: Heme oxygenase-1; NQO1: NAD(P) H: Quinone oxidoreductase-1; GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3　讨论

近年来，随着人民生活水平的提高、生活方式和饮食结构的改变以及影像诊断技术的进步和广泛应用，NAFLD的发病率日益增高。过量高脂饮食是引起NAFLD发生的最常见因素，脂质代谢紊乱导致肝细胞内脂质过度蓄积(主要为TG)是形成NAFLD的先决条件[10]。体外脂肪变性细胞模型是国内外开展NAFLD研究的重要载体，本实验以HepG2细胞为研究对象，参考国内外多种脂肪变性细胞模型的造模方法进行改进[11-14]，采用含25%胎牛血清、0.1%医用脂肪乳和0.1 mmol/L FFA的DMEM培养基分时段和梯度诱导的方法，可以建立脂肪变性HepG2细胞模型。研究结果表明模型组细胞油红O染色病理可见细胞肿胀变大，细胞内出现较大的橘红色和红色脂滴，部分脂滴甚至融合成链；HepG2细胞内TG水平也在24 h后明显升高，提示HepG2细胞脂变模型建立成功。本研究建立的脂肪变性HepG2细胞模型为脂肪肝在体外环境的研究进行了有益的尝试和探索，为筛选有效的抗NAFLD治疗药物提供了较好的载体。

氧化应激是 NAFLD 发生发展过程中的中心环节[15]。研究表明，NAFLD发病过程中肝细胞内脂质的异常蓄积使线粒体β氧化速度代偿性扩大，为脂质过氧化提供了足够的反应基质，产生了大量具有反应活性和细胞毒性的ROS[16,17]。ROS不仅使细胞内抗氧化物质大量消耗，使微粒体脂质过氧化反应增强，导致氧化与抗氧化失衡，引起肝细胞损害加重，导致呼吸链功能下降，ATP合成障碍，引起NO和脂质过氧化产物MDA的增多，而清除氧自由基的GSH-Px、SOD大量减少[18-20]。本研究结果表明脂肪变性HepG2细胞抗氧化反应酶活性降低，同时脂质过氧化反应增强，提示氧化应激和脂质过氧化参与了细胞脂肪变性的过程，这与NAFLD动物实验的结果存在一致性[21]。

Nrf2/ARE通路是近年新发现的机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路。Nrf2是抗氧化酶表达过程中的关键调控因子，对于稳定氧化-抗氧化的平衡，减轻氧化应激导致的损害可起到关键性的作用[22]。生理条件下，Nrf2在细胞质中与Keap1结合处于非活性、易降解的状态，并不断地泛素化降解，无法进入细胞核发挥转录活性[23]；当细胞受到氧化应激、亲电子物质作用和化学物质刺激下，Keap1的构象改变或者Nrf2直接被磷酸化，导致Nrf2与Keap1解离后活化，活化的Nrf2从胞浆转入细胞核，与ARE结合，启动ARE调控的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白类、泛素酶以及蛋白酶体的基因表达，其中HO-1、NQO1等下游Ⅱ相解毒酶激活后，发挥其在细胞氧化应激损伤的条件下保护细胞的作用[24,25]。本研究结果表明模型组Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平较正常组显著升高，提示25%胎牛血清、0.1%医用脂肪乳和0.1 mmol/L FFA诱导HepG2细胞后，可以引起细胞发生脂肪变性和氧化应激状态，Nrf2/ARE通路及其下游相关因子HO-1、NQO1发生激活，启动细胞防御性保护机制，Nrf2/ARE防御性转导通路参与的氧化应激可能是NAFLD发生发展的重要机制之一。

综上所述，自由基介导的氧化应激广泛参与了NAFLD发生、发展的过程，Nrf2/ARE通路作为调控多种抗氧化酶转录表达的最为重要的内源性抗氧化应激通路，相对于以往的外源性抗氧化策略，对于它的适度、可控的调节，将为从体内抗氧化防治NAFLD开辟新的途径。

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Expression and significance of Nrf2/ARE pathway ralated factors in the HepG2 cell model of steatosis

ZHANG Yu-pei1， KONG Yi-lin2， YANG Qin-he1△， JIN Ling3， LIANG Yin-ji1， HE Yi-fang1，DENG Yuan-jun1， LI Yuan-yuan1， WANG Guan-long1， CHENG Shao-bing1

(1. Department of Traditional Chinese Medicine， Medical College, Jinan University, Guangzhou 510632； 2. Department of Oncology, Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006； 3. The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510632， China)

Objective: To explore a new method of establishing HepG2 cell model of steatosis and observe the expression and significance of nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2(Nrf2)/antioxidative response element(ARE )pathway related factors in HepG2 cells of steatosis. Methods: HepG2 cells were induced with DMEM containing 25% fetal bovine serum, 0.1% MCT/LCT Fat Emulsion and 0.1 mmol/L free fatty acid (FFA) at different stages and the control group cells were cultured with normal DMEM medium. After the cell models were successfully established, lipid droplets in cytoplasm were observed with Oil Red O staining, and the triglyceride(TG) accumulation in HepG2 cells were tested by biochemical assay. Intracellular reactive oxygen species (ROS) concentration were detected by flow cytometry. Nitric oxide(NO), superoxide dismutase(SOD), malonyldialdehyde(MDA) and glutathione peroxidase(GSH-Px) were tested by biological reagent kit, while the protein expression of nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2(Nrf2), heme oxygenase-1(HO-1) and NAD(P)H: quinone oxidoreductase-1(NQO1) were analyzed by Western blot. Results: Compared with that in the control group, red cytoplasmic lipid droplets were visible in model group; TG,ROS, NO, MDA concentration (P<0.05,P<0.01) and the protein expression of Nrf2、HO-1 and NQO1(P<0.05,P<0.01)were significantly higher in model group, while SOD, GSH-Px concentration reduced significantly(P<0.01). Conclusion: The in vitro cell model of steatosis and oxidative stress was successfully established. The activation of Nrf2/ARE pathway related factors maybe relevant to the overreaction of oxidative stress in HepG2 cells of steatosis.

HepG2 cells;steatosis;Nrf2/ARE pathway;oxidative stress

国家自然科学基金资助项目(81302878，81273617)；中国肝炎防治基金会天晴肝病研究基金(cfhpc20132184)；暨南大学第一临床医学院科研培育专项基金(2014205)

2015-02-28

2015-10-09

△Tel：020-85226197； E-mail：tyangqh@jnu.edu.cn

R34

A

1000-6834(2016)01-013-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.004