电针联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用*

黄萍 郭俐宏陈少秀（湖北省十堰市太和医院，湖北医学院附属医院，湖北十堰442000）

·实验报告·

电针联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用*

黄萍 郭俐宏△陈少秀
（湖北省十堰市太和医院，湖北医学院附属医院，湖北十堰442000）

目的观察电针联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠对大鼠脑缺血/再灌注损伤的保护作用。方法SD大鼠40只，按随机数字表法分为模型组、电针组、穴位注射组及联合组，4组大鼠均采用右侧颈动脉线栓大脑中动脉Willis环，阻断血流45min后再灌注45min，并反复3次的方法，建立大鼠脑缺血/再灌注损伤的动物模型。电针组施平补平手法，取风池、百会、四神聪、肾俞、三阴交为主穴电针刺激30min；穴位注射组穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；联合组治疗方法为电针组加穴位注射组；观测0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d局部脑血流量（RCBF）、脑电图病理性棘波波幅（EEG）；取脑组织TTC染色后记数顶叶皮质层幸存神经元，并分别测定脑梗死率、血浆肌酸激酶同工酶BB（CK-BB）。结果联合组在第7日、14日、21日显著提高RCBF及幸存神经元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，与模型组、电针组及穴位注射组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论其作用机制应与电针刺激以疏通经络、激发经气，松弛缺脑血管平滑肌、改善微循环而增加RCBF，单唾液酸四己糖神经节苷脂钠营养、再生与重构中枢神经细胞，电针与穴位注射共同促进缺血脑能量代谢而起到保护作用有关。

电针联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠脑缺血/再灌注损伤局部脑血流血浆肌酸激酶同工酶BB

【Abstract】Objective:To observe the protective effect of electroacupuncture combined with acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside on cerebral ischemia/reperfusion in rats.M ethods:40 SD ratswere randomly divided into the model group，electro acupuncture group，acupoint injection group and the combined group.Four groups of rats received the right carotid artery occlusion of middle cerebral artery occlusion Willis ring，45minutes after reperfusion for another 45minutes，and repeating 3 times to establish the animalmodel of brain injury ischemia/reperfusion in rats.Electro acupuncture group took reinforcing technique，taking Fengchi，Baihui，Sishencong，Shenshu，Sanyinjiao acupoints electroacupuncture for 30 min.Acupoint injection group took acupoint injection of sodium monosialotetrahexosylganglioside.The combined group took electro acupuncture and acupoint injection.The data of 0min，4 hours and 1st day，7thday，14thday and 21stday was observed，such as regional cerebral blood flow（RCBF），EEG pathologic spines；popo（EEG）from the brain tissue TTC staining.The number of survival neurons in parietal cortex，and the cerebral infarction rate were measured，as well as serum creatine kinase isoenzyme BB（CK-BB）.Results:On 7thday，14thday，21stday，surviving neuron density and RCBF obviously rose，and CK-BB，pathological spike wave amplitude of EEG and rate of infarction dropped. Compared with the other groups，the differenceswere statistically significant（P《0.05）.Conclusion:Themechanism may be related to the stimulation of electroacupuncture，which can dredge the channels，promote themovementof the channel Qi，relax cerebral vascular smoothmuscle，and improvemicrocirculation to increase RCBF.At the same time，sodium monosialotetrahexosylganglioside can nourish，regenerate and reconstruct the central ner-vous system.Electroacupuncture combined with acupoint injection can promote cerebral energy metabolism in cerebral ischemia，so as to play a protective role.

【Key words】Electroacupuncture combined with acupoint injection；Sodium monosialotetrahexosylganglioside；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Local cerebral blood flow；Plasma creatine kinase isoenzyme BB

脑梗死（ACI）即急性缺血性脑卒中，是血管粥样硬化脱落斑块栓塞脑血管而引起急性血流障碍，造成局灶性脑缺血梗死，并最终导致脑功能障碍的一类急性脑功能缺损疾病［1］。其起病急促，致残率及病死率极高，是临床严重威协人类健康的疾病。根据中医“正气存内，邪不可干”的观点［2］，寻找有效的防治急性缺血性脑卒中方法、减轻脑缺血/再灌注对神经元损害、促进神经元功能恢复成为当务之急。笔者应用大鼠缺血再灌注损伤模型，采用“风池、百会、四神聪、肾俞、三阴交”电刺激并联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠路注射液，观察其对大鼠缺血/再灌注后局部脑血流量（RCBF）及叶皮质层幸存神经元等的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组SD大鼠40只，体质量160～200 g，雌雄不拘，由湖北省实验动物中心提供，实验动物设施使用许可证：SYXK（鄂）2011-0031；实验动物生产许可证：SCXK（鄂）2011-0008。采用随机数字表编号，随机分为模型组、电针组、穴位注射组及联合组，每组10只。术后每日碘伏消毒，头孢哌酮0.2 g/（kg·d）肌肉注射，动物房温度保持18～25℃，湿度保持50%～75%，大鼠应单笼饲养，12 h交替光照，苏醒后自由饮水、喂养，每日观察动物进食情况，称体质量，及时清理粪便［3］。

1.2试药及仪器BL-420L生物信号采集记录系统（成都市泰盟公司）。FM-600科研型倒置数码荧光系统（上海普丹光学仪器有限公司，型号FM-600）；电解式组织血流计（日本松下，FBR-1）；精密电子天平（上海精密电子天平医疗仪器公司，FA-1004）；医学影像分析仪（日本SNOY，X52-H）。栓线（将钓鱼线剪成长约50 mm，并在18 mm处作标记，酒精消毒后置于生理盐水中备用）。SDZ-II型电子针疗仪（上海坤弘，型号SDZ-II）；单唾液酸四己糖神经节苷脂钠（长春翔通药业有限公司，批号H20066833）；弗氏完全佐剂（上海实生细胞生物技术有限公司）；0.9%氯化液注射液；TTC染色剂（上海日初生物科技有限公司）。

1.3模型制备参考文献［4］，将动物用3%戊巴比妥钠（10mg/100 g）经腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台，颈部正中切口，分离出右侧颈总动脉并找到颈总动脉入颅之翼腭动脉起始部，分离翼腭动脉并用微动脉夹夹闭，置另一微动脉夹同时夹闭右侧颈总动脉及颈内动脉主干远心端。在颈外动脉近心端剪一T字小口，用制备好的栓线缓慢插入，此时将颈外动脉残端处丝线的松结拉紧，除去颈内动脉的动脉夹，继续将丝线沿着颈内动脉插入18 mm或有阻力感即阻塞了大脑中动脉Willis环，阻断血流30 min后再灌注30min并反复3次后即可抽出丝线并除去微动脉夹。分层关闭颈部肌肉及皮肤，术后共有39只大鼠存活，术后24 h以局部脑血流量及脑电图幅度急剧下降，左侧前肢内收，提尾悬空不能伸展左侧前爪，行走向左侧转圈为入选标准，挑选其中32只大鼠符合脑缺血再灌注损伤动物模型入选标准，模型成功率为80%。电针组手术同上但不插入栓线阻塞了大脑中动脉Willis环。

1.4干预方法参照大鼠穴位图谱文献［5］，电针组取“风池、百会、四神聪、肾俞、三阴交”为正极，施平补平手法用一次性无菌针灸针齐刺至针感，旁开5～8 mm为负极，接SDZ-Ⅱ型电子针疗仪，连续波，频率10 Hz，留针30 min；穴位注射组取“百会、足三里、血海”穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液（0.1mL）；联合治疗组先给予电针组相同治疗，在电针治疗后休息1 h，取“百会、足三里、血海”穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液；模型组每日仅作对照观察。以上治疗每日1次，7 d为1个疗程，连续治疗3疗程。

1.5标本采集与检测1）脑梗死率及幸存神经元测定。4组大鼠于治疗21 d后断头处死，参照大鼠穴位图谱文献［6］，迅速分离脑组织后滤纸吸干称重，-20℃冰冻30 min，37℃的1%TTC避光染色30 min后用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋、将视交叉平面至乳头体后部平面切成2mm厚脑片，由于梗死区着色加深，精确剥离梗死部位，精密电子天平精确称量并记录重量，计算梗死率［脑梗死率（%）=（梗死部位质量/脑总质量）×100%］。光镜下记数观察幸存神经元密度值，采用C5 0.5网形目镜尺分号别对各组大鼠顶皮质Ⅰ区进行记数，记数与任一测点外上角和测线（横线）上缘交叉的幸存神经元，每片脑片取3个视野，每鼠共42个视野，累加记数取均值，即为该鼠幸存神经元密度值。2）局部脑血流量（RCBF）、生物信号采集记录系统记录及脑电图（EEG）及血浆肌酸激酶同工酶（CK-BB）测定。RCBF（mL/100 g/min）采用日本生物医药公司生产的电解式组织血流计（FBR-1）测量。在大鼠的颅顶右侧皮下安置银丝电极，采用EEG棘波波幅，大鼠缺血/再灌注0min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG波幅（参数设置为速度12mm/div；波宽0.05 s；电压2 mV；频率100 Hz）。

1.6统计学处理采用SPSS15.0统计软件分析。RCBF及EEG的影响采用重复测量方差分析，CKBB、梗死率及幸存神经元密度值比较采用两两比较t检验，计量资料以（±s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠CK-BB、梗死率及幸存神经元密度值比较见表1。电针组及穴位注射组CK-BB、梗死率有一定程度降低，幸存神经元密度值明显提高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），电针组及穴位注射组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；联合组CK-BB、梗死率明显降低，幸存神经元密度值明显提高，与电针组及穴位注射组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组大鼠脑缺血梗死率、CK-B B及幸存神经元密度值比较

表1　各组大鼠脑缺血梗死率、CK-B B及幸存神经元密度值比较

与模型组比较，*P＜0.05；与电针组比较，△P＜0.05；与穴位注射组比较，▲P＜0.05。

组别幸存神经元（个/100mm2）梗死率（%）模型组1.12±0.15 33.18±2.74 n CK-BB（IU/L）8 531.18±45.74电针组1.52±0.18*25.01±2.35*8 450.01±43.35*穴位注射组8 422.32±37.62*2.17±0.21*27.33±2.42*联合组8 341.17±26.97△▲3.10±0.27△▲18.54±1.75△▲

2.2各组大鼠RCBF比较见图1。BL-420L记录显示，4组大鼠采用右侧颈动脉线栓大脑中动脉Willis环后，RCBF立即急剧下降，在4 h时降至最低点，治疗至第7日时，模型组维持在低水平，电针组、穴位注射组及联合组均有不同程度升高，其中电针组、穴位注射组组间比较无差异，联合组升高明显优于电针组、穴位注射组，且于第14日已恢复至正常水平。

图1　各组大鼠RCB F比较

2.3各组大鼠EEG比较如图2。4组大鼠脑缺血再灌注0 min、4 h及1 d、7 d、14 d、21 d EEG图形变化情况。各组大鼠在阻塞了大脑中动脉Willis环术后EEG棘波波幅即刻均急剧上升，于4 h达峰值。治疗7 d时电针组、穴位注射组降低并持续到21 d，联合组降低更明显，与电针组、穴位注射组比较降低更明显。

图2　各组大鼠E EG比较

3　讨论

缺血性脑卒中时，实验室检查常见RCBF降低及出现异常EEG，血浆CK-BB在脑损伤极为敏感［7］，此时脑组织因缺血缺氧，能量供应不足，细胞Na-K+-ATP酶大量释放，导致线粒体的结构及功能破坏，细胞能量代谢发生障碍，加速神经细胞凋亡。单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液主要成分为单唾液酸四己糖神经节苷脂钠，系自猪脑中提取制得的对神经细胞功能损伤具有修复和保护作用的物质。其与神经细胞膜结合，改善细胞膜酶的活性减轻脑细胞水肿，对损伤后继发性神经退化有保护作用，可治疗脑萎缩脑梗死、脊髓损伤、脑出血、新生儿缺氧缺血性脑病颅神经病变［8］。

在治疗21 d时实验结果显示，测得值显示，联合组在第7日、14日、30日3个时点显著提高RCBF及幸存神经元密度值、降低CK-BB、EEG病理性棘波波幅及梗死率，且这种改变明显优于电针组及穴位注射组。本实验表明，电针“风池、百会、四神聪、肾俞、三阴交”穴，针刺穴位能激发经气，疏通经络，符合“治未病”中医的观点［9］，治疗当以调补肝肾、益精生髓、醒脑开窍、舒经通络为治法［10］。风池、百会、四神聪、肾俞、三阴交等穴位是历代中医治疗脑瘫的经验穴，其中百会、四神聪位于头部，头为诸阳之首，是脏腑经络汇聚之所，针刺二穴具有通调督脉、醒脑益智，激发人体阳气之功效；风池为祛风要穴，配以肾俞及三阴交，可舒经通络、补益气血、强筋健骨，从而纠正患儿肢体畸形及异常姿势，促进肢体功能的恢复［11］。故电针以上穴位时，扩张局部脑血管，增加RCBF，进而减少了其脑梗死面积。经穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液吸收后，该药具有生理作用是促进“神经重塑”［12］。幸存神经元密度值增高提示该药物可能具有改善细胞膜系统的钙运转能力，减少钙离子在线粒体内过多的堆积，促进细胞的能量代谢以恢复缺血再灌注受损的脑组织功能。单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液可稳定细胞膜的结构和功能、恢复细胞Na-K+-ATP酶活性，促进缺血性脑卒中时受损中枢神经系统神经细胞代谢，抑制损伤神经细胞异常放电，降低EEG病理性棘波波幅，增加幸存神经元密度值［13］。大量临床及实验研究证实单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液作为神经营养因子的增强剂，具有增加RCBF，促进受损神经轴突生长与重构，提高缺血缺氧神经细胞存活率、调节突触的信号传导与脑电活动，对神经中枢系统起到良好的保护作用［14-15］。

综上所述，电针联合穴位注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液对大鼠脑缺血/再灌注损伤具有明确的保护作用。这与单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液改善脑组织的能量代谢，促进脑神经细胞功能恢复，减轻缺血再灌注后脑组织损伤，电针疏通经络，增加RCBF，改善病灶缺血、水肿，减少脑梗死面积而对脑组织起到保护作用相关。

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Protective Effect of Electroacupuncture Combined w ith Acupoint Injection of Sodium M onosialotetrahex-osylganglioside on Cerebral Ischem ia/Reperfusion in Rats

HUANG Ping，GUO Lihong，CHEN Shaoxiu.Department of Dermatology，Taihe Hospital Affiliated Hospital of Hubei Medical College，Hubei，Shiyan 442000，China.

R245．9文献标志码：A

1004-745X（2016）07-1335-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.022

湖北省卫生厅重点项目（2012Z-B06）
△

（电子邮箱：chends1226@163.com）

2015-11-18）