侧脑室注射丹参酮对脑瘫模型大鼠神经行为学的影响*

刘清忠 王大斌 韩丽梅 曹觅 齐旭升（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000）

·研究报告·

侧脑室注射丹参酮对脑瘫模型大鼠神经行为学的影响*

刘清忠 王大斌 韩丽梅 曹觅 齐旭升△
（湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北十堰442000）

目的观察侧脑室注射丹参酮对脑瘫模型大鼠神经行为学的影响，探讨其可能机制。方法Wistar大鼠30只，分为模型组和丹参酮组，采用手术切除大脑皮质和部分大脑组织的方法建立脑瘫模型。丹参酮尾静脉给药治疗15 d。用水迷宫仪进行定位航行和空间探索实验，并用悬吊试验和斜坡试验比较大鼠行神经行为学改变，测定治疗前后外周血丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。结果丹参酮组大鼠水迷宫中找平台次数减少，找到平台时间和悬吊试验掉头转向上时间显著缩短，大鼠在第1象限和中环停留时间明显延长，定位航行中潜伏期和游泳距离降低，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。外周血MDA和NO明显降低，SOD明显增高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论丹参酮能促进脑瘫大鼠学习记忆能力，其作用机制有可能为丹参酮扩张大脑微动脉，增加脑组织血流量，并通过增强SOD的活性来降低MDA和NO对脑组织神经细胞的损害，达到改善大鼠缺血缺氧状态从而促进神经组织功能的恢复。

丹参酮脑瘫动物模型大鼠神经行为学学习记忆能力

【Abstract】Objective：To establish a rat animal model of cerebral palsy，to observe the effect of intracerebroventricular injection of Tanshinone on neurological behavior and to explore the possible mechanism of treatment of cerebral palsy.M ethods：30Wistar ratswere divided into themodel group and tanshinone group，ratanimalmodel of cerebral palsy established by surgical resection of the cerebral cortex and brain tissue.Tanshinone intravenous injection was taken for 15 days，watermaze apparatus for positioning navigation and space exploration experiments，and suspension testand ramp test rat nerve behavioral changes.Before and after treatment，contentof peripheral blood MDA，NO and SOD wasmeasured.Results：Rats of tanshinone group in Morris watermaze reduce the number of finding a platform，and finding time and the time of turning up significantly shorten.Residence time in the first quadrant and the central reduced.Latency and swimming distance were decreased in positioning navigation.Compared withmodel group，the difference was statistically significant（P《0.05）.The peripheral blood MDA and NO decreased significantly；SOD increased significantly.Compared with model group，the differencewas statistically significant（P《0.05）.Conclusion：Tanshinone can promote learning and memory ability of cerebral palsy rats，whosemechanism may be related with tanshinone's expanding brain arteriole，increasing cerebral blood flow，and enhancing SOD activity to reduce damage of MDA and NO to the brain nerve cells，and improve ischemia hypoxia state of rats so as to promote the recovery of nerve function.

【Key words】Tanshinone；Animalmodel of cerebral palsy；Rat；Neuroethology；Learning and memory ability

脑性瘫痪（CP）是出生前到出生后数月内脑发育阶段因脑组织缺血缺氧等多种原因导致的脑损伤、脑发育缺陷所致的智力及躯体运动障碍性综合征［1］。CP是脑组织出现病理性改变，临床以中枢性运动功能障碍为主，并伴有智力低下、语言障碍等临床表现［2］。因CP的发生发展是因脑组织缺血缺氧等因素引起，而丹参酮的主要有效成分为丹参酮、丹参素和丹参酮甲酯等［3］具有抗组织缺氧、清除自由基、扩张微循环和血管调节等功能［4］。故本实验设计应用丹参酮侧脑室注射，利用其扩管作用直接作用于脑组织，来观察其对CP大鼠神经行为学的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物与分组雄性Wistar大鼠30只，体质量（200±20）g，由十堰市太和医院科技中心动物房提供［许可证SYXK（鄂）2011-0031］，实验均在科技中心标准动物实验室［SCXK（鄂）2011-0008］完成。动物分组前先用随机数字表编号，随机分为对照组、模型组和丹参酮组各10只。

1.2试剂与仪器Morris水迷宫视频分析系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；ZS-B型大鼠立体定位仪（北京众实迪创科技发展有限责任公司）；丹参酮（上海第一生化药业有限公司，批号H31022558）；水合氯醛（上海展云化工有限公司，批号302-17-0）。

1.3造模与给药参照文献［5］方法，模型组及丹参酮组大鼠经腹腔注射水合氯醛30mg/kg麻醉。俯卧位固定于小动物手术台上，剪去头顶部位鼠毛，用体积分数75%的乙醇消毒后铺无菌手术巾，行颅顶后正中切口（2 cm），逐层切开皮肤及皮下组织，用拉钩向两侧拉开皮肤，刮去骨膜暴露矢状缝，用牙科钻钻出直径0.6 cm小孔形成颅骨窗，用眼科手术刀沿颅骨窗边缘切开硬脑膜以暴露出大脑皮质，再用眼科手术刀沿颅骨窗边缘切开深约4mm的大脑皮质，小心剥离出大脑皮质及部分大脑髓质，然后用医用棉纱压迫止血，生理盐水冲洗创面，分层缝合皮下组织和皮肤，用碘伏消毒皮肤。对照组麻醉后行颅顶后正中切口，15 min后分层缝合皮下组织。造模后第1日，丹参酮按10mg/ （kg·d）的用量，从尾静脉注射丹参酮注射液给药，每日1次。对照组和模型组按1 mL/（kg·d）从尾静脉注射生理盐水，每日1次。3组均治疗15 d。

1.4观察指标参照文献［6］拟定，采用悬吊试验和斜坡试验观察肢体肌力及躯体平衡功能的随意运动。采用Morris水迷宫试验法观察学习记忆能力［7］，空间探索实验时撤掉迷宫仪中平台，观察大鼠1、7、15 d在水迷宫中寻找平台的运行轨迹。于治疗前和治疗第15日从大鼠眶静脉取250μL静脉血，肝素抗凝，测试盒测定治疗前后用丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量。

1.5统计学处理应用SPSS17.0统计软件处理。实验数据均以（±s）表示，采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1各组一般情况比较对照组运动灵活，舔毛自洁、摄食及饮水正常，无动物死亡。模型组大鼠肢体活动少、跛行、左前肢及左前爪屈曲痉挛、精神及自洁情况差，摄食及饮水量减少，2只死亡。丹参酮组大鼠治疗后精神较模型组稍好，会舔毛自洁，肢体活动、摄食及饮水逐步接近正常，无动物死亡。

2.2各组大鼠随意运动比较见表1。对照组运动灵活、稳定性好，动作敏捷、准确，悬吊时间长，斜坡试验反应迅速，及时将头转向上方，用时较短。模型组运动灵活性降低，稳定性差，右侧肢体无力颤抖，悬吊试验很快掉落桌，斜坡试验反应迟缓，不能及时将头转向上方，用时较长，悬吊试验和斜坡试验用时与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮组大鼠治疗后悬吊试验时间缩短，斜坡试验时间缩短，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1　各组大鼠随意运动比较（±s）

表1　各组大鼠随意运动比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，△P＜0.05。下同。

组别n悬吊试验（min）斜坡试验（s）对照组10 4.19±0.37 3.49±0.25模型组8 1.01±0.13△5.43±0.34△丹参酮组10 2.87±0.21*4.02±0.27*

2.3各组大鼠空间探索试验比较见表2。模型组大鼠学习找平台所需的次数和时间明显增多，第1、2象限停留时间明显降低，大鼠在中环停留长于内环和外环，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮组大鼠治疗后大鼠学习找平台所需的次数明显减少，大鼠在第1象限和中环停留时间明显延长，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　各组大鼠空间探索试验结果比较（±s）

表2　各组大鼠空间探索试验结果比较（±s）

组别n学习找平台次数（n）内环（s）中环（s）外环（s）第1象限（s）第2象限（s）第3象限（s）第4象限（s）对照组10 4.32±0.37 10.57±1.02 60.23±7.35 54.24±6.97 40.36±7.29 33.65±4.21 22.37±3.61 25.63±5.31模型组8 7.36±0.42△16.32±1.87△45.37±5.96△40.68±5.74△35.39±3.32△23.54±4.31△19.25±3.54 21.35±5.24丹参酮组10 6.01±0.34*14.24±1.72 63.64±8.25*43.25±7.95 71.01±8.65*37.52±3.97 17.32±3.70 19.33±2.94

2.4各组大鼠定位航行试验比较见表3。模型组大鼠潜伏期及游泳距离明显增多，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮组大鼠治疗后大鼠潜伏期及游泳距离明显明显减少，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5各组大鼠海马NO、MDA和SOD水平比较见表4。模型组大鼠MDA和NO明显增高，SOD明显降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参酮组大鼠治疗后MDA和NO明显降低，SOD明显增高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3　各组大鼠定位航行试验结果比较（±s）

表3　各组大鼠定位航行试验结果比较（±s）

与本组治疗前比较，*P＜0.05；与对照组治疗后比较，△P＜0.05。下同。

组别时间潜伏期（s）游泳距离（cm）对照组1 d 49.54±22.13 841.07±78.21 （n=10）7 d 32.01±22.2 450.47±72.14 15 d 26.21±21.14 240.42±52.19模型组1 d 156.85±23.24 839.03±87.89 （n=8）7 d 123.87±18.37△741.13±72.31△15 d 131.62±20.51△786.13±61.75△丹参酮组1 d 150.24±21.75 827.05±77.65 （n=10）7 d 102.23±15.02*524.56±79.72*15 d 71.02±11.24*326.54±45.37*

表4　各组大鼠海马NO、MDA和SOD水平比较（±s）

表4　各组大鼠海马NO、MDA和SOD水平比较（±s）

组别时间SOD（U/L）对照组治疗前140.04±15.71 （n=10）治疗后141.50±15.21模型组治疗前58.71±6.31 NO（nmoL/mL）MDA（nmoL/mL）7.24±0.21 6.41±0.30 8.50±0.29 5.96±0.20 18.21±10.39 25.30±3.49 （n=8）治疗后61.51±10.05△21.51±12.75△24.89±2.27△丹参酮组治疗前19.30±12.17 27.97±4.37 59.09±6.12 （n=10）治疗后9.21±0.27*11.24±1.75*127.20±15.2*

3　讨论

CP是继脊髓灰质炎被控制后造成小儿肢体残疾的主要疾病，本实验通过手术切除部分大脑皮质来破坏脊髓中央前回及中央后回，从而破坏大部分对侧躯体的感觉及运动中枢，引起上运动神经元麻痹，制造大脑皮质及部分大脑髓质小儿脑瘫类似的脊髓灰质损伤，以模拟CP相似病理改变和临床症状。因是脑组织出现病理性改变，故临床以持续存在的中枢性运动和姿势发育障碍、活动受限［8］。本实验中采用国内外较为公认行为学检测方法鉴定方法作为CP模型的鉴定标准，水迷宫仪进行定位航行和空间探索试验，悬吊试验和斜坡试验可直观反应大鼠行神经行为学改变［9］。实验显示，比照对照组，模型组大鼠肢体活动少、跛行、左前肢及左前爪屈曲痉挛、精神及自洁情况差，摄食及饮水量减少，2只死亡。神经行为学检测发现运动灵活性降低，稳定性差，右侧肢体无力颤抖。悬吊试验很快掉落桌，斜坡试验反应迟缓，不能及时将头转向上方，学习找平台所需的次数和时间明显增多，第1、2象限停留时间明显降低，大鼠在中环停留长于内环和外环。潜伏期及游泳距离明显增多，以上现象说明造模成功，造模后随意运动障碍、学习记忆能力下降。丹参酮组在治疗后，较模型组明显好转，大鼠肢体活动、精神、自洁情况、摄食及饮水量明显增多，无动物死亡。神经行为学检测悬吊试验时间增加，斜坡试验反应较模型组敏捷，将头转向上方用时、学习找平台所需的次数和时间明显减少，大鼠在第1象限和中环停留时间明显延长，潜伏期及游泳距离明显减少，提示治疗后随意运动障碍、学习记忆能力增强。

丹参酮是从丹参中纯化分离出的二萜醌类化合物［10］。丹参味辛、性凉、具凉血消痈、活血通经［11］，现代医学亦证实丹参中的丹参素及丹参酮具有活血化瘀的药效，药物吸收后可通过扩张脑血管、增加脑血流量，提高抗凝和纤溶活性，降低血液黏滞度，减少血小板聚集，改善血流动力学而达到抗组织缺血缺氧状态［12］。同时，通过增强SOD活性达到消除氧自由基及减少脑组织兴奋性氨基酸的释放，降低应激性而发挥组织保护作用［13］。有研究表明，造成CP病理改变是神经细胞淀粉（Aβ）合成过多造成神经原纤维缠结，引起脑组织不溶性淀粉样沉积而形成斑块［14］。而MDA可使溶解状态下Aβ的转化为聚集态的Aβ加速脑内的沉积和缠结而加重CP的临床症状［15］。模型组大鼠记忆力明显下降并出现认知功能和肢体运动协调能力减退，其主要原因就是MDA上调诱导神经细胞的凋亡。而丹参酮组治疗后SOD升高，SOD可减轻脂质过氧化反应，有效对抗MDA上调，明显改善大鼠智力障碍，增强空间学习记忆能力。其机制可能与丹参酮减少淀粉样沉积、加速斑块的清除、提高大鼠的抗氧化能力、清除机体过多的氧自由基、抑制自由基损伤、减轻机体组织和细胞过氧化反应过程和细胞毒作用有关［16］。另有研究表明NO生成过量时会通过与脂肪、蛋白质、核酸等相互作用，破坏机体细胞的内稳态而产生毒性作用［17］。而NO过量生成会进一步促进Aβ聚集加重对神经细胞毒，加重脑组织损害，丹参酮可能在这个过程中阻滞某一阶段，减少自由基产生而缓解CP疾病发展。

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Ef fect of Intracerebroventricular Injection of Tanshinone on Neurobehavioral M odel of Cerebral Palsy Rats

LIU Qingzhong，WANGDabin，HAN Limei，etal.Taihe Hospital，Hubei，Shiyan 442000，China.

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）07-1281-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.005

湖北省科技厅项目（2013BCB002）
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（电子邮箱：glhguolihong1226@126.com）

2016-03-04）（

2015-11-07）