丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠心肌细胞高迁移率族蛋白-1、肿瘤坏死因子-α表达的影响及机制*

汪德坤 魏汉维 彭戬（湖北省武汉市东湖医院，湖北武汉430074）

·综述·

丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠心肌细胞高迁移率族蛋白-1、肿瘤坏死因子-α表达的影响及机制*

汪德坤 魏汉维 彭戬
（湖北省武汉市东湖医院，湖北武汉430074）

目的观察丹参酮ⅡA对高迁移率族蛋白B1（HMGB-I）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在脓毒症大鼠心肌细胞的表达的影响。方法雄性SD大鼠45只随机分为正常组（A组）、脓毒症组（B组）及丹参酮ⅡA+脓毒症组（C组），采用HE染色和ELISA法测定心肌组织中的TNF-α含量，Western blot法检测心肌组织中HMGB-1的表达。结果HE染色显示B组大鼠心肌纤维水肿、疏松，间质充血水肿，胶原纤维增多，可见部分心内膜内皮细胞水肿脱落，而C组心肌病理改变较B组轻。ELISA法测定心肌组织TNF-α含量，Western blot法检测心肌组织中HMGB-1的表达，B组都较C组明显增加（P＜0.05），心肌凋亡指数B组与C组也有明显差异（P＜0.05）。且以上改变C组与A组也存在差异（P＜0.05）。结论丹参酮ⅡA可以减少脓毒症大鼠心肌组织TNF-α及HMGB-I的表达，对脓毒症心肌抑制有保护作用。

脓毒症丹参酮ⅡA高迁移率族蛋白-1肿瘤坏死因子-α

【Abstract】Objective:To observe the influence and mechanism of tanshinoneⅡA on the expression of HMGB-I and TNF-αof cardiomyocyte in ratswith sepsis.M ethods:45male SD ratswere random ly divided into 3 groups：the normal group（group A），sepsis group（group B），tanshinoneⅡA+sepsis group（group C），using HE staining and ELISA method to determine the contentof TNF-αinmyocardial tissue，Western blotmethod to detect the expression of HMGB-1 in myocardial tissue.Results:HE staining showed that in group B，there were myocardial fibers edema，osteoporosis，interstitial hyperemia and edema，increased collagen fibers，the visible part of the endocardial endothelial edema，and myocardial pathological changes compared with group B and group C.Group B was significantly increased compared with the group C in ELISA method to determine content of TNF-αin myocardial tissue and Western blotmethod to detect the expression of HMGB-1 inmyocardial tissue（P《0.05），and myocardial apoptosis index of group B and group C also had obvious difference（P《0.05）.And the changes above and the differences also existed in the comparison between group A and group C（P《0.05）.Conclusion:TanshinoneⅡA can reduce the expression of TNF-αand HMGB-Iofmyocardial tissue of rat in sepsis，has a protective effect tomyocardial inhibition in sepsis.

【Key words】Sepsis；TanshinoneⅡA；Highmobility group protein 1；Tumor necrosis factor alpha

心功能不全是脓毒症的常见并发症之一，近50%的脓毒症患者可出现不同程度的心肌抑制，病死率高达70%～90%［1］。心肌细胞凋亡是引起脓毒症心肌抑制的重要因素［2］。炎症早期的重要炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可促进心肌凋亡，TNF-α通常在脂多糖刺激几分钟内即开始释放，在2 h左右达高峰，并在随后2 h内迅速下降至无法测出［3］，而且利用TNF-α拮抗剂治疗脓毒症也多以失败告终，提示在脓毒症后期的病理生理过程中有其他晚期炎症介质参与。研究发现晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）参与了脓毒症心肌损伤的炎症反应以及其他病理生理过程［4-5］。此外，Ha等［6］发现，抑制内毒素诱导的HMGB-I的释放能提高脓毒症小鼠的生存率。丹参酮ⅡA有抗炎、免疫调理、抗氧化、稳定血管内皮等作用，发现其可以减少脓毒症死亡率［7］，但其机制一直不清楚。本实验

旨在观察脓毒症大鼠心肌细胞HMGB-I及TNF-α的表达，并观察丹参酮ⅡA干预对其表达的影响，探讨丹参酮ⅡA心脏保护性作用的机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物SD雄性大鼠45只购自苏州大学实验动物中心［合格证号SCXK（苏）2008-0005］，体质量230～320 g。

1.2药物与试剂丹参酮ⅡA磺酸钠（上海第一生化药业有限公司，国药准字Z20026249）。TNF-αELISA试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。HMGB-1抗体购自Sigma-Aldrich公司。

1.3分组与给药雄性大鼠45只，正常喂养1周后随机分为对照组（A组）、脓毒症组（B组）、丹参酮ⅡA+脓毒症组（C组）各15只。C组开始腹腔注射丹参酮ⅡA磺酸钠0.1 mL/只，每日1次，持续2周。A组和B组注射同体积的0.9%氯化钠注射液，每天1次，持续2周。

1.4模型制备喂养2周后B组和C组采用盲肠结扎穿孔法构建脓毒症大鼠模型［8］。术前禁食8 h，10%水合氯醛（0.3mL/kg）腹腔注射麻醉，消毒大鼠腹部皮肤，于腹部正中做2 cm纵切开腹，钝性分离盲肠，在盲肠末端1 cm处用4-0号丝线环形结扎盲肠，保持肠道通畅，避免损失血管。在距结扎远端5mm处采用9号针头穿刺3次，轻挤出肠内容物适量，缝合关闭腹腔。各组术后48 h处死。

1.5标本采集与检测1）心肌形态学检测。大鼠心肌组织分别经甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋切片、HE染色，置光学显微镜下观察心肌组织病理变化。2）心肌TNF-α及HMGB-1含量测定。处死大鼠取左室心肌组织，分别给予0.9%氯化钠注射液冲洗、匀浆离心（3000 r/min，15 min），取上清液备用。心肌组织中TNF-α含量采用ELISA法测定，操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书进行。HMGB-1的表达采用Western blot法检测［9-10］，采用GAPDH作为内参，以其条带吸光度值作为标准，以HMGB-1/GAPDH条带吸光度比值作为HMGB-1蛋白表达的相对量。3）心肌细胞凋亡检测。大鼠心肌组织分别经过甲醛固定、乙醇脱水以及石蜡包埋切片，心肌细胞凋亡的检测按照TUNEL试剂盒说明书进行，以凋亡指数（AI）作为评价心肌细胞凋亡情况的指标，AI=视野内凋亡细胞数/视野内所有细胞数。

1.6统计学处理应用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，计数资料采用χ2检验。P《0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组HE染色结果比较见图1。A组大鼠的心肌细胞、胶原纤维含量正常、间质结构正常；B组大鼠心肌细胞、间质充血水肿，胶原纤维含量增多，部分心内膜内皮细胞出现水肿及脱落；C组心肌组织病理改变与B组相同，但较B组轻。

图1　丹参酮ⅡA对脓毒症大鼠心肌组织的影响（HE，4 0 0倍）

2.2各组心肌组织TNF-α、HMGB-1水平及心肌凋亡指数（AI）比较见表1。与A组相比，B组心肌细胞TNF-α、HMGB-1表达及AI指数显著增加（P《0.01）。C组大鼠心肌细胞TNF-α、HMGB-1表达及AI指数较B组明显减少（P《0.05）。

表1　各组心肌组织TNF-α、HMGB-1表达及A I水平比较（±s）

表1　各组心肌组织TNF-α、HMGB-1表达及A I水平比较（±s）

与A组比较，△P＜0.05；与B组比较，▲P＜0.05。

组别n AI C组15 0.09±0.01▲△A组15 0.04±0.01 B组15 0.22±0.03△TNF-α（pg/mL）HMGB-1（ng/mL）25.61±2.42▲0.40±0.05▲△21.14±3.32 0.20±0.04 47.35±4.31△0.84±0.05△

3　讨论

心肌功能障碍在脓毒症高死亡率中扮演着十分重要的角色。早在1951年，Waisbren等就发现脓毒症所导致的心肌功能异常现象，但其具体的发病和作用机理不明确。研究发现脓毒症时，体循环中存在大量的抑制心脏功能的细胞因子，其共同作用于心肌组织，出现心肌缺血缺氧性改变，最终可导致心肌细胞的凋亡、坏死，从而引起心脏功能的异常改变［11-12］。TNF-α是脓毒症早期的主要炎症介质，在脓毒症中TNF-α显著增加，与心肌功能障碍相关。同时，TNF-α还能刺激单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞合成IL-1，而IL-1在脓毒症休克中起着中心作用。研究显示，IL-1对心肌有负性肌力作用，抑制心肌收缩，脓毒症时心肌收缩力与顺应性多出现异常改变［13］。HMGB-1是脓毒症过程中一个较晚出现的关键炎症介质，可显著促进炎症因子如IL-1、IL-6、TNF-α以及C反应蛋白和巨噬细胞炎性蛋白等的释放，从而发挥促炎作用［14］。Deng等研究表明，HMGB-1具有促凋亡和促炎性反应等作用，可加重心肌损伤的病理生理过程［15］。研究发现，A组心肌纤维排列整齐，无炎性细胞浸润，而B组大鼠心肌细胞肿胀，炎性细胞浸润，凋亡细胞体积变小，蛋白表达也提示B组TNF-α、HMGB-1明显增加；给予丹参酮ⅡA处理后，C组心肌组织TNF-α、HMGB-1表达明显下降，心肌损害明显改善，心肌凋亡指数明显下降。因有研究发现，丹参酮ⅡA能抑制NF-κB活性增强［16］，而TNF-α、IL-1及HMGB-1表达均受NF-κB调控［17］，故脓毒症大鼠经丹参酮ⅡA处理后TNF-α及HMGB-1表达明显下降，丹参酮ⅡA对脓毒症心肌损伤有保护作用，但是C组与A组相比仍有差异，这也说明丹参酮ⅡA并不能完全抑制脓毒症心肌损伤，但其能抑制炎症反应仍然是脓毒症治疗的主要方向，其机制需要进一步的探索。

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In fluence and M echanism of TanshinoneⅡA on the Expression of HMGB-I and TNF-αof Cardiomy-ocyte in Ratsw ith Sepsis

WANG Dekun，WEIHanwei，PENG Jian.Donghu Hospital，Hubei，Wuhan 430074，China.

·研究报告·

R285.5文献标志码：A

1004-745X（2016）07-1272-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.002

国家自然科学基金资助项目（30500657）；湖北省自然科学基金（211CDB196）