电针足三里穴对大鼠小肠缺血再灌注损伤后肠黏膜屏障修复的影响*

耿艳霞 陈栋 鲁俊 陈明祺 张海东 周江（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

·临床观察·

电针足三里穴对大鼠小肠缺血再灌注损伤后肠黏膜屏障修复的影响*

耿艳霞 陈栋 鲁俊 陈明祺 张海东 周江△
（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

目的研究电针足三里穴对大鼠小肠缺血再灌注（I/R）损伤后肠黏膜屏障的保护作用。方法将24只大鼠随机分为4组，即正常组、模型组、假电针组、电针组，每组各6只。于缺血30min再灌注2 h时，分别取大鼠门静脉血和远端回肠标本，检测回肠组织病理学评分（Chiu′s），ELISA法检测血清中白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度，Western blot法检测肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1浓度。从回肠灌注FITC-Dextran-4溶液30min后，测算其在血清中的浓度，观察肠黏膜通透性的改变。结果与对照组比，I/R组和假电针组大鼠病理学Chiu′s评分和血清TNF-α、IL-6、FD4水平明显升高，ZO-1表达明显减少（P《0.05）；与I/R组和假电针组比，电针足三里可降低肠黏膜损伤评分，抑制血清TNF-α、IL-6和FD4水平（P《 0.05），促进ZO-1修复。结论电针足三里对大鼠小肠I/R损伤肠黏膜屏障具有保护作用。

电针缺血-再灌注损伤足三里穴肠屏障功能

【Abstract】Objective：To investigate the protection effectof electroacupuncture（EA）at Zusanli（ST36）on rat intestinal ischemia/reperfusion（I/R）injury.M ethods：Twenty-fourmale SD ratswere random ly divided into the control group（shame group），I/R group（themodel group），sham EA group（I/R+sham EA），and EA group（I/R+ EA），with 6 rats in each.Intestinal I/R ratmodel was based on superiormesenteric artery occlusion for 30 min and releasing for 2h，and distal ileum tissue and portal blood sampleswere taken for further detection.The pathological changes of ileum tissue were viewed and graded by Chiu′s score.Serum levels of IL-6 and TNF-αwere detected with ELISA method.Intestinalmucosal concentrations of tight junction protein ZO-1 were investigated with western blot assay.A solution of FITC-Dextran-4 solution was injected into a segment of terminal ileum for 30 min，and then the serum level of FD4 wasmeasured to assess the intestinal permeability.Results：Compared to the control group，Chiu′s score and serum TNF-α，IL-6，FD4 levels in I/R and sham EA group significantly increased，while ZO-1 expression significantly decreased.Compared with the I/R and shame EA group，EA at Zusanli（ST36）significantly promoted ZO-1 repair，and attenuated the pathological damage and serum levels of TNF-α，IL-6 and FD4.Conclusion：EA at Zusanli（ST36）can protect the intestinalmucosal barrier from I/R injury.

【Key words】Electroacupuncture；Ischemia/reperfusion injury；Zusanli（ST36）；Intestinal barrier function

肠道的缺血再灌注损伤常见于多种临床疾病，如严重创伤、烧伤、脓毒症、肠梗阻、肠移植、肠系膜动脉栓塞、失血性休克、腹主动脉手术等，是引起肠黏膜屏障功能受损的主要因素之一。肠上皮细胞结构和功能的破坏，将引起肠屏障功能障碍，肠黏膜通透性升高，细菌和内毒素易位，诱发全身炎症反应综合征（SIRS）甚至多脏器功能障碍综合征（MODS），是临床上经常遇到的难题。因此，探索促进缺血再灌注后肠屏障损伤修复的有效措施，具有重要的临床意义。目前，探索治疗肠道缺血再灌注损伤策略的研究众多，如缺血预处理、抗氧化、补充NO及谷氨酰胺等，大多尚停留在动物模型层面，且疗效不确切。针灸疗法临床应用十分广泛，特别是针刺足三里穴在肠道缺血性疾病的临床应用亦日益普遍，并取得了独特的疗效优势。电针疗法是针灸疗法的一个分支，较单纯针灸有治疗效果好、范围广、易控制刺激量及可做持续运针等多种优点。既往研究验表明，电针足三里穴可增加缺血再灌注肠黏膜血流量和二胺氧化酶（DAO）活性，减轻肠组织水肿，抑制促炎因子水平［1-2］，然而对肠黏膜屏障特别是紧密连接蛋白表达的影响却未见报道。本实验旨在探讨电针足三里穴对小肠缺血再灌注损伤后炎症反应和黏膜屏障的保护作用，为临床胃肠功能障碍的电针治疗提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验动物清洁级SD大鼠24只，雄性，体质量180～220 g，购自南京中医药大学附属医院动物实验中心。

1.2试剂白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）的ELISA试剂盒购自R＆D公司；异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FD4，MW 4400）购自Sigma公司；兔抗大鼠ZO-1抗体购自Santa cruz公司，HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自GenScript公司。

1.3分组与造模24只大鼠随机分为4组，即正常组、缺血再灌注损伤组、假电针组、电针组，每组各6只。小肠缺血再灌注损伤模型制作：将大鼠适应性饲养1～2周，氯胺酮腹腔麻醉后，取剑突下1 cm腹正中切口，游离肠系膜上动脉，以无损伤动脉夹夹闭其起始部，建立肠缺血模型。回纳肠管，以湿润的纱布覆盖腹腔，30 min后松开血管夹，恢复肠系膜上动脉血流，建立再灌注模型。正常对照组同上剖腹、游离，但不夹闭血管。

1.4干预方法电针组缺血后即刻针刺双侧足三里穴（膝关节外后侧，腓骨小头下5 mm），直刺7 mm，针刺后接电针仪，频率2～100 Hz，强度2～3 mA，时间30 min，以大鼠双下肢出现轻微颤动为度。假电针组缺血后即刻以相同频率和强度电针双侧非经非穴（足三里外侧旁开0.5 cm）。

1.5标本采集与检测于再灌注2 h时处死大鼠，取1 cm远端回肠组织（距回盲部2 cm处）；抽取2mL门静脉血，冰上静置，离心，吸出上层血清于-80℃冻存；切除末端回肠10 cm肠段，置于预冷的生理盐水中纵行剖开，漂洗去除粪便及表面血迹，用载玻片于冰上快速刮取表面黏膜，收集后于-80℃冻存。

1.5.1病理学检查取回肠组织置于10%甲醛中，室温下固定，常规HE染色，光镜下按Chiu's法评价肠黏膜损伤程度：0分为正常绒毛；1分为绒毛顶端上皮下损伤，Gruenhagen间隙增大；2分为上皮下间隙扩张，上皮与固有层呈中度分离；3分为上皮下间隙进一步扩张，上皮层与固有层间呈大量分离，偶有绒毛顶端裸露；4分为绒毛破损裸露，伴固有层毛细血管扩张；5分为固有层破坏、不完整、溃疡和出血。

1.5.2肠黏膜通透性测定于再灌注1.5 h用2-0丝线结扎10cm末端回肠肠管（距回盲瓣5 cm），向该段肠腔内注入FD4溶液0.5mL（20mg/mL），30min后取门静脉血1～2mL，冰盒中静置，离心。取0.2mL上清血浆，用荧光分光光度计测荧光强度（EX=480 nm，EM=520 nm，PMT=400 V）。以不同稀释浓度的FD4标准品及相应荧光强度制作标准曲线，在标准曲线上换算出各样品的FD4浓度。

1.5.3Western blot法检测ZO-1蛋白取0.1 g回肠黏膜组织，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液，充分研磨，冰上静置，离心，提取上清蛋白液，测定总蛋白浓度，调整标本浓度至1 g/L左右。蛋白变性后行SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，封闭后一抗（ZO-1，1∶500）4℃孵育过夜，HRP二抗（1∶1000）室温孵育2 h，加显色剂后暗室中曝光，冲洗胶片，以β-actin作参照校正，用凝胶图像分析系统分析目标条带灰度。

1.5.4ELISA法检测血清中IL-6和TNF-α的水平

操作按照试剂盒说明书进行，每个反应孔中滴加50μL血清样本和50μL生物素标记的IL-6或TNF-α抗体，37℃温育1 h；洗涤后加入60μL的亲和链霉素-HRP，37℃温育30min；洗涤后加入底物，37℃温育10min后加入终止液，使用酶标仪测定各孔OD值（波长450 nm），由标准曲线换算出各样品的IL-6和TNF-α含量。

1.6统计学处理应用SPSS18.0统计软件处理。计量资料以（±s）表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠回肠小肠组织病理学改变见图1，表1。缺血再灌注损伤组及假电针组大鼠肠黏膜损伤明显，绒毛脱落，固有层破坏，毛细血管暴露，大量中性粒细胞浸润。电针组肠黏膜损伤较轻，仅有极少量绒毛脱落，中性粒细胞浸润减少。Chiu′s评分在电针组明显低于缺血再灌注损伤组及假电针组（P＜0.05）。

图1　各组大鼠回肠光镜组织病理学改变（HE染色，1 0 0倍）

2.2各组大鼠回肠肠黏膜通透性测定见表1。I/R组和假电针组大鼠血清的FD4浓度明显高于正常对照组，电针组的FD4浓度与缺血再灌注损伤组和假电针组相比都有显著降低（P《0.05）。

表1　各组回肠组织C h i u′s评分和血清F D 4浓度比较?

2.3各组大鼠肠黏膜紧密连接蛋白表达见图2。与正常组比较，缺血再灌注损伤组和假电针组回肠黏膜组织紧密连接蛋白ZO-1表达明显减少，电针组ZO-1较缺血再灌注损伤组和假电针组均显著增加。

图2　大鼠回肠黏膜ZO-1蛋白

2.4各组大鼠血清IL-6和TNF-α水平比较见表2。缺血再灌注损伤组和假电针组血清IL-6和TNF-α浓度明显高于正常对照组，电针组IL-6和TNF-α浓度与缺血再灌注损伤组和假电针组相比都有显著降低（P《0.05）。

表2　各组血清IL-6、TNF-α水平比较（p g/mL，±s）

表2　各组血清IL-6、TNF-α水平比较（p g/mL，±s）

组别n IL-6 TNF-α电针组6 84.5±20.8*#△20.3±6.7*#△正常组6 46.3±7.8 15.9±4.3缺血再灌注损伤组6 158.2±37.1*47.5±11.5*假电针组6 151.1±44.9*45.7±22.7*

3　讨论

针灸古籍即有“肚腹三里留”之说，足三里穴是治疗胃肠疾病的经典穴和首选穴，临床上应用十分广泛，其治疗效果被众多医务工作者及患者所认可。大量的临床实践和动物实验证实，针刺对消化道的运动、分泌及消化吸收机能具有调整作用，可引起胃蛋白酶原、生长抑素、内皮素含量下降，NO及血管活性肠肽增加，在胃肠功能紊乱尤其是功能性胃肠道疾病的治疗方面具有良好疗效，其主要机制可能与止痛及促进胃肠蠕动有关［3］。而电针调节肠I/R损伤肠屏障结构及功能方面研究较少，仅有宋铁山及胡森等人在电针抑制凋亡及炎性损伤方面进行过研究［1-2，4］，本实验中我们针对肠屏障中重要的分子-紧密连接蛋白ZO-1进行了进一步研究。肠上皮细胞紧密连接是细胞间连接的主要方式，其中，ZO-1是一种220KD的膜蛋白，它将跨膜蛋白Occludin和Claudins的胞内端与骨架蛋白actin相连接［5］，在肠黏膜的机械屏障中起到至关重要的作用，在肠黏膜通透性的维持和损伤后修复中都起着重要作用［6］。本研究结果发现，肠黏膜缺血再灌注时，ZO-1表达明显降低，电针足三里可以明显促进缺血后ZO-1表达恢复及屏障功能修复。

研究中还发现，电针足三里穴对小肠缺血再灌注后炎性损伤还有显著抗炎效应，可明显降低重要炎性介质IL-6和TNF-α水平。众多关于炎性疾病的实验已证实，针灸穴位具有抑制促炎因子生成和提高抗炎因子水平的作用。研究表明，电针足三里可以改善盲肠结扎穿孔模型（CLP）大鼠的肠道损伤和高渗透性，提高肠黏膜上皮细胞中sIgA浓度和CD4+/CD8+比率，减少总体死亡率［7］；能改善脓毒症患者的肠道通透性，尽快恢复肠道功能，早期实现目标喂养［8］。电针的这种抗炎效应主要是通过激活胆碱能抗炎通路、拮抗过度炎性损伤实现的。电针足三里的针刺信息可上传到中枢，影响中枢迷走核团，兴奋迷走神经及胆碱能通路。而腹腔迷走神经切断将消除电针的保护作用，加重促炎因子表达及器官功能损伤［9-10］。此外，电针足三里穴对大鼠感染性休克［11］、失血性休克［12］、肝缺血再灌注损伤［13］、内毒素所致肝损伤［14］等均具有很好的抗炎效应和器官保护作用，但若预先切断双侧迷走神经干或注射α7 nAChR拮抗剂，其治疗作用则明显减弱或消失，说明激活胆碱能抗炎通路可能是电针足三里发挥抗炎和脏器保护作用的主要机制之一，并且主要通过N型胆碱能受体α7 nAChR发挥作用［15］。目前认为，α7 nAChR被激活后，主要通过抑制核因子κB（NF-κB）通路和启动酪氨酸激酶JAK2/信号转导和转录激活子3 （STAT3）通路，从而抑制内毒素、创伤等诱导的促炎细胞因子的产生［16］。最近，Dhawan S等研究还表明，M型胆碱能受体在结肠炎体外实验中对损伤组织也有保护作用，其机制可能与阻断肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的转录及肌球蛋白轻链（MLC）的磷酸化有关［17］。紧密连接蛋白的破坏/开放是肠道黏膜屏障受损的关键，MLCK已被证明是诱导肠上皮紧密连接开放的一个至关重要的蛋白质，通过对肌球蛋白轻链（MLC）进行磷酸化，诱导周围连接的肌动蛋白和肌球蛋白丝收缩，对紧密连接和细胞表面产生张力，从而使上皮细胞间紧密连接开放［18］；而刺激M型G-蛋白耦联受体后，可能通过激活磷脂酶C（PLC），阻断MLC磷酸化，促进紧密连接转移到细胞膜，使得紧密连接保持关闭状态，从而维护上皮屏障功能。以上电针基于胆碱能抗炎通路治疗炎性疾病相关机制的深入探讨，都将有助于电针足三里穴治疗肠道缺血性疾病机制的阐明。

综上，本实验结果表明，电针足三里穴能显著抑制大鼠小肠缺血再灌注损伤后炎症反应，改善肠黏膜通透性及紧密连接蛋白表达，促进肠黏膜结构和功能修复。其机制可能与刺激胆碱能通路中N型及M型受体有关，这将是我们今后研究的方向和重点，以期为临床治疗提供理论支持。

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Effects of Electroacupuncture at Zusanli（ST36）on Mucosal Barrier Repair in Rats with Intestinal Is-chem ia Reperfusion Injury

GENG Yanxia，CHEN Dong，LU Jun，et al.Affiliated Hospital of Nanjing Univer-sity of TCM，Nanjing 210029，China.

·研究报告·

R245.9+7文献标志码：A

1004-745X（2016）07-1300-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.07.011

江苏省中医院院级课题（Y14015）；江苏省中医药管理局项目（JD201501）
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（电子邮箱：1967chch@163.com）

2016-04-15）