EV71 IgM抗体均相酶联免疫检测方法的初步建立

崔雨 王颖 甘星 宋娟 韩俊

450000郑州人民医院（崔雨）；261000潍坊医学院（王颖）；430000武汉医疗救治中心（甘星）；102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室（宋娟、韩俊）崔雨，王颖为并列第一作者

EV71 IgM抗体均相酶联免疫检测方法的初步建立

崔雨 王颖 甘星 宋娟 韩俊

450000郑州人民医院（崔雨）；261000潍坊医学院（王颖）；430000武汉医疗救治中心（甘星）；102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室（宋娟、韩俊）
崔雨，王颖为并列第一作者

目的 建立一种快速检测肠道病毒71型（EV71）IgM抗体的均相ELISA新技术。方法 首先克隆表达纯化EV71 VP1蛋白，使用生物素标记该蛋白。通过ELISA法摸索出Bio-EV71 VP1的最适抗原量为0.0375 μg。优化供体微球、受体微球、血清等实验反应体系，建立EV71 VP1的均相酶联免疫检测方法的IgM检测技术。使用EV71感染的手足口病（HFMD）患者和健康人血清进行均相酶联免疫检测方法检测评价，并与ELISA检测结果相比较。结果 获得EV71 VP1纯化蛋白并生物素化。摸索出均相酶联免疫检测方法的体系：5 μg/m1受体微球、0.037 5 μg生物素化的VP1、20 μg/m1供体微球、血清2 μ1，总体系为20 μ1。采用ELISA和均相酶联免疫检测方法检测方法对样本血清进行IgM检测。两种方法同时检出手足口病患者1gM阳性16份；14份ELISA法检出阴性样本中，均相酶联免疫检测方法法检出阳性6份。20份健康人血清，2种方法检测结果均为阴性。结论 本研究初步建立了EV71 VP1 IgM的均相酶联免疫检测方法。

【主题词】 EV71；VP1；IgM；均相酶联免疫检测方法基金项目：传染病重大专项（2013ZX10004-001）

Fund program：China Mega-Project for Infectious Disease（2013ZX10004-001）

手足口病是我国婴幼儿常见的疾病，以发热和手、足、口腔、臀部等部位出现皮疹、疱疹等为主要临床表现，少数患儿可引起无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎样麻痹及脑炎等并发症，甚至出现死亡［1，2］。而肠道病毒71型（EV71）是引起重症病例的主要原因。研究表明，EV71衣壳蛋白VP1表面的峡谷样结构是受体分子的结合位点［3，4］。目前，针对EV71病毒血清IgM的检测方法耗时较长，且受多种因素干扰［5］。而均相ELISA技术是一种基于微球偶联发光物质的新型均相检测技术，由于抗原抗体相互作用使得供受体微球之间的化学发光物质发生级联反应而产生放大信号。均相酶联免疫检测方法利用长波长680 nm激发，短波长615 nm发射，避开了来自组织中荧光的背景，避免了血清样本中因为溶血而引起的干扰。与传统的酶联免疫检测方法比较，均相酶联免疫检测方法具有敏感性高、检测背景低、不要洗涤步骤等特点，可以检测组织、全血等样本中的抗体、抗原和物质［6］。因此，本研究拟建立 HFMD血清的 EV71 IgM均相酶联免疫检测方法检测方法。

1 材料与方法

1.1质粒、菌种及生化试剂 pET-30a（+）质粒、BL21（DE3）感受态细胞为本实验室保存，EV71 VP1基因从病人标本中提取RNA后经RT-PCR反转录而来，相关试剂购自美国 Invitrogen。针对 EV71 VP1的单克隆抗体anti-EV71 VP1（ab36367）购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠二抗购自美国Santa-Cruz公司。生物素化试剂盒（Biotin 1abe1ing kit）购自日本同仁化学研究所。均相酶联免疫检测方法受体与供体微球购自美国PerkinE1mer公司。EV71-IgM ELISA检测试剂盒购自万泰公司。

1.2全长EV71 VP1蛋白的表达纯化及鉴定 根据报道序列（GenBank：HM579945.1）设计、合成EV71 VP1全基因引物，上游5′-CATATG GGA GAT AGG GTG GCA GAT GT-3′，下游5′-CTCGAG GTA AAG AGT GGT GAT CGC TGT GC-3′，同时分别在上、下游引物的5'端加入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。将所得PCR产物连接至pET30a表达载体。常规诱导表达蛋白后，利用镍离子亲和层析柱进行蛋白纯化。将纯化后的EV71 VP1蛋白以anti-EV71 VP1单抗为一抗进行Western B1ot鉴定。

1.3EV71 VP1蛋白的生物素化及最适浓度的确定 生物素化过程按照说明书进行操作。为评价VP1抗原的生物素化效果，将EV71 VP1抗体按照1∶2 000稀释包被酶标板4℃过夜。加入以1 μg为起始浓度倍比稀释生物素化抗原。孵育1 h，洗涤，加入1∶1 000 HRP标记的链霉亲和素，显色15 min，检测吸光度。

1.4EV71-lgM均相酶联免疫检测反应体系 选择经ELISA方法证明EV71 IgM阳性样本3份和阴性样本2份，确定均相酶联免疫检测体系。以受体微球10 μg/m1、供体微球40 μg/m1、血清量5 μ1和生物素化VP1蛋白量为0.0375 μg，总体系为50 μ1，以检测值/对值≥2.1作为阳性结果判定标准。体系稳定后优化实验条件：供体微球浓度从40 μg/ m1至20 μg/m1进行调整，受体微球从10 μg/m1至5 μg/m1浓度调整范围，样本量在1～5 μ1之间调整。

1.5均相酶联免疫检测方法检测EV71 IgM方法的建立 收集30例HFMD患儿的血清样本（发病后1～9 d采集）和20例健康儿童的血清样本作为对照。使用 ELISA方法检测样本确定血清中的IgM。根据优化的均相酶联免疫检测方法反应体系检测上述样本，依次加入2 μ1的血清样本、8 μ1的2.5×抗μ链受体微球、生物素化的抗原0.0375 μg的混合物至384微孔板中，室温孵育1 h。再加入10 μ1的2×偶联有链霉亲和素的供体微球，室温避光孵育30 min。使用Enspire-A1pha检测仪检测，检测值是阴性对照值的2.1倍判断为阳性。与ELISA检测方法比较来评价均相酶联免疫检测方法的有效性。

2 结果

2.1重组EV71 VP1的表达纯化与鉴定 PCR产物片段大小约891 bp，与预期VP1全基因序列长度一致；经常规镍离子交换诱导 Western B1ot结果显示0.1 μg和0.05 μg的蛋白可被特异性单抗识别，呈现出明显的反应条带，与预期蛋白相对分子质量大小一致，约为34 kD。结果显示成功表达纯化出EV71 VP1蛋白（图1）。

2.2生物素标记的VPl蛋白最适浓度确定 按照均相酶联免疫检测方法的要求，我们将纯化的VP1蛋白进行生物素标记，通过生物素标记后VP1蛋白浓度约为0.8 mg/m1。通过ELISA鉴定，生物素标记的VP1蛋白显示良好的特异性反应。以检测孔OD值/对照孔OD值比≥2.1为阳性确定指标，结果显示大于0.0375 μg的标记蛋白检测与对照孔的比值均≥2.1。

图1　EV71 VP1蛋白的Western B1ot鉴定1.His-GST protein as a contro1.2.EV71 0.05 μg VP1 protein；3.0.1 μg VP1 protein Protein marker was showed in the 1eftFig.1 EV71 VP1 was identified by Western B1ot

2.3均相酶联免疫检测方法检测体系建立 经反复试验后得到一个稳定的检测体系：5 μg/m1受体微球、0.0375 μg生物素化的VP1、20 μg/m1供体微球、血清2 μ1，总体系为20 μ1。

2.4均相酶联免疫检测方法的应用及方法评价通过ELISA检测显示30例手足口病样本中EV71 IgM阳性样本16例，20例健康儿童血清样本全部为阴性。优化的均相酶联免疫检测，显示16例患儿血清1gM阳性样本，均相酶联免疫检测也均显示为阳性。均相酶联免疫检测方法检测20份正常人血清样本，结果显示均为阴性。然而，14份ELISA检测结果为阴性的手足口病患者的血清样本，经均相酶联免疫检测方法检测出现6份阳性结果（表1）。

3 讨论

肠道病毒71型感染可引起手足口病重症病例。重症病例可因合并脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、神经源性肺水肿、呼吸循环衰竭而危及患儿生命或留有后遗症。因此，手足口病患者及时诊断是否为EV71感染显得尤为重要。然而，现有EV71感染手足口病血清IgM抗体诊断方法存在一些缺点，如检测步骤繁琐、反复洗涤等。由于酶结合检测，组织中尤其血清中因溶血而引起免疫球蛋白、血红蛋白、风湿因子对检测结果的判断影响非常大。因此，建立一种低背景的均相EV71血清IgM实验室诊断技术具有非常重要的作用。

我们初步建立了EV71 IgM的均相酶联免疫检测方法。该方法检测血清的样本量仅为2 μ1，而且该方法整个过程无需洗涤，与相应的检测仪器配合，可达到检测速度快、通量高、背景低的特点。通过临床样本进一步验证了EV71 IgM的均相酶联免疫检测方法，结果显示具有很好的特异性，然而，在ELISA检测阴性样本检出了阳性结果，我们分析可能存在两种原因，可能ELISA方法的敏感性较差，难以检出部分EV71感染患者血清中的IgM；也可能建立的均相酶联免疫检测方法的特异性不够。因此，我们建立的EV71IgM均相酶联免疫检测方法还需要更大量的样本来进一步验证和评价。

表1　均相酶联免疫检测方法与ELISA法检测结果比较Tab.1 Comparison between homogeneous enzyme immunosorbent assay and ELISA

［1］ Ishimaru Y，Nakano S，Yamaoka K，et a1.Outbreaks of hand，foot，and mouth disease by enterovirus 71：high incidence of comp1ication disorders of centra1 nervous system.Arch Dis Chi1d，1980，55：583-8.doi：10.1136/adc.55.8.583.

［2］ Me1nick JL.Enterovirus type 71 infections：a varied c1inica1 pattern sometimes mimicking para1ytic po1iomye1itis.Rev Infect Dis，1984，6：S387-90.doi：10.1093/c1inids/6.Supp1ement_ 2.S387.

［3］ Shih SR，Li YS，Chiou CC，et a1.Expression of capsid protein VP1 for use as antigen for the diagnosis of enterovirus 71 infection.J Med Viro1，2000，61：228-34.doi：10.1002/（SICI）1096-9071（200006）61：2＜228：：AID-JMV9＞3.0CO；2-R.

［4］ Yu CK，Chen CC，Chen CL，et a1.Neutra1izing antibody provided protection against enterovirus type 71 1etha1 cha11enges in neonata1 mice.J Biomed Sci，2000，7：523-8.doi：10.1007/ BF02253368.

［5］ 王颖.EV 71 A1phaLISA检测EV71 IgM方法的建立.安徽理工大学，2011，doi：10.7666/d.y1976328.

［6］ Bie1efe1d-Sevigny M.A1phaLISA immunoassay p1atform-the“nowash”high-throughput a1ternative to ELISA.Assay Drug Dev Techno1，2009，7：90-92.doi：10.1089/adt.2009.9996.

Primary establishment of a homogeneous enzyme immunosorbent assay for EV71 IgM of HFMD serum

Cui Yu，Wang Ying，Gan Xing，Song Juan，Han JunPeople′s Hospital of Zhengzhou，Henan 450000，China（Cui Y）.WeiFang Medical University，Shandong 261000 China（Wang Y）.Wuhan Medical Treatment Center，Hubei，430000，China（Gan X）.State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control.National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Song J，Han J）. Cui Yu and Wang Ying are the first authors who contributed equally to the article

Han Jun，Email：hanjun_sci@163.com；Song Juan，Email：helen831020@126.com

Objective To deve1op new homogeneous enzyme immunosorbent assay for serum IgM antibody of EV71 infection.Methods After protein EV71 VP1 1-297 was purified and biotiny1ated，the optima1 quantities of the antigen was obtained by ELISA.The homogeneous enzyme immunosorbent assay was va1uated with the serum samp1es of both 20 hea1thy subjects and 30 samp1es from the patients of HFMD detected by ELISA.Results The reaction system of homogeneous enzyme immunosorbent assay for EV71 IgM was estab1ished in this study.Then the homogeneous enzyme immunosorbent assay was va1uated with ELISA for EV71 IgM.The resu1ts revea1ed serum IgM were negative for the 20 hea1thy subjects by both ELISA and homogeneous enzyme immunosorbent assay.Of the 30 HFMD patients，positive serum EV71 IgM detected by both ELISA and homogeneous enzyme immunosorbent assay，and yet，6 IgM positive samp1es were identified with homogeneous enzyme immunosorbent assay in the 14 negative samp1es detected by ELISA.Conclusion A homogeneous enzyme immunosorbent assay for detection of serum EV71 IgM has been estab1ished.

EV71；VP1；IgM；homogeneous ELISA

韩俊，Emai1：hanjun_sci@163.com；宋娟，Emai1：he1en831020@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.027

2016-03-03）