自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备

苏秋东 郭敏卓 邱丰 贾志远 卢学新 孟庆玲 田瑞光 高燕 毕胜利 伊瑶

102206中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肝炎室（苏秋东、邱丰、贾志远、卢学新、孟庆玲、田瑞光、高燕、毕胜利、伊瑶）；100026北京出入境检验检疫局保健中心（郭敏卓）

自发生物素化风疹病毒重组诊断抗原的制备

苏秋东 郭敏卓 邱丰 贾志远 卢学新 孟庆玲 田瑞光 高燕 毕胜利 伊瑶

102206中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所肝炎室（苏秋东、邱丰、贾志远、卢学新、孟庆玲、田瑞光、高燕、毕胜利、伊瑶）；100026北京出入境检验检疫局保健中心（郭敏卓）

目的 获取原核表达过程中自发生物素化的风疹病毒（Rube11a Virus，RV）重组抗原E1（RV-E1），并初步评价其抗原性。方法 将2×BirA酶底物（BSP）插入到RV-E1抗原优势表位区域aa 148-295的羧基端，硫氧还蛋白（Thioredoxin，TRX）插入到RV-E1的氨基端，密码子优化后全基因合成；在大肠埃希进行表达，并利用亲和层析和离子交换层析纯化获取生物素化的RV-E1抗原；利用Western B1otting技术对目的蛋白进行鉴定，并建立风疹病毒IgM抗体检测方法，初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。结果 获取高度均质的生物素化的可溶性RV-E1抗原，WB实验表明目的蛋白不但可以被RV-E1抗原和TRX抗原单克隆抗体识别，而且可以被标记HRP的链霉亲和素所识别。分别对50份风疹病毒感染阳性血清、阴性血清和健康人血清进行检测，发现一致性优异。结论 RV-E1诊断抗原携带BSP，可以在大肠埃希菌表达过程中自发共价结合生物素分子，并可以作为新型诊断抗原应用于生物素-亲和素ELISA血清学检测中。

【主题词】 BirA酶底物；风疹病毒E1抗原；原核表达；生物素化抗原

生物素-蛋白连接酶（BirA酶）是由大肠埃希菌组成性基因BirA编码的一个双功能蛋白，它可以通过识别蛋白质序列的特异位点对目的蛋白进行生物素化。作为一种关键代谢酶，BirA酶可以催化生物素共价偶联到乙酰辅酶A羧化酶生物素羧基载体蛋白（BCCP）赖氨酸残基的ε-氨基上，这个反应通过一种酶联腺苷酸（bio-5'-AMP）的酰基活化机制推动［1］。只要目的蛋白的氨基或羧基端携带生物素化的肽底物序列（BSP）基因，使其在富含BirA酶的大肠埃希菌中进行融合表达，就能产生共价偶联生物素分子的目的蛋白［2-4］。

D.Beckett等［5］确定了 BirA酶催化生物素化反应的最小底物序列为GLNDIFEAQKIEW H，并且证实其生物素化程度与自然底物BSP相近。本研究就是利用这段肽序列能被BirA酶特异识别的特性，将其排布在RV-E1诊断抗原的羧基端，使其在大肠埃希菌中表达出生物素化的RV-E1诊断抗原，并依托生物素-亲和素系统建立风疹病毒感染IgM抗体诊断ELISA方法，有效地避免了因为酶偶联目的蛋白引起抗原效价降低以及提高了诊断灵敏度。

风疹病毒（Rube11a virus）属于披膜病毒科风疹病毒属，成年人群中风疹病毒感染率一般在80%～90%，一般为轻微的、自限型疾病，但妊娠期前三个月感染将会导致胎儿损伤，婴儿出生后伴随着先天性风疹综合症畸形。风疹病毒的三个结构蛋白（核心衣壳蛋白C、两个膜糖蛋白E1和E2）均可以引发抗体应答，但只有E1蛋白为免疫显性的［6］。已鉴定出E1糖蛋白的几个表位，如aa 245-285、aa 213-239、aa 214-240。Bosma等［4］提出 E1蛋白的aa195-296包含了血凝素和中和抗原决定簇，并对比分析这个区域在氨基酸水平上高度保守。免疫沉淀和免疫印迹技术已经证实，大部分抗RV抗体应答主要由E1蛋白诱发，血凝素活性和病毒中和活性都归于E1蛋白的 aa 208-239、aa 213-239、aa 214-240［7-9］。三个另外的血凝素和中和表位被认为在E1蛋白的aa245-285［10］。伊瑶［11］将RV-E1 aa 148-295区域与硫氧还蛋白（TRX）融合表达，以此抗原建立血清学检测方法检测200份来自我国广西省的未知血清样本发现阳性率为93%，与文献报道的我国其他地区风疹病毒抗原阳性率基本一致。但长期实验发现［12］，此蛋白经过HRP偶联后极易失活或抗原效价降低，因此本研究希望通过偶联链霉亲和素来避开偶联诊断抗原，并利用生物素-亲和素系统提高诊断的灵敏度。

本研究选用的RV-E1抗原片段为aa 148-295，将其羧基端添加2×BSP，并且保留TRX前缀，并在TRX氨基端添加His标签，进而构建可以应用亲和层析的自发生物素化的RV-E1诊断抗原。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 E.coli BL21（DE3）为科室现存，限制性内切酶NdeI和XhoI以及T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司，pET43.1a载体购自美国Novagen公司，Che1ating Sepharose Fast F1ow和DEAE Sepharose Fast F1ow层析介质购自美国GE公司，兔anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，鼠抗anti-Rube11avirusE1monoc1ona1antibody以 及Streptavidin-HRP均购自Abcam公司。风疹病毒感染急性期血清50份、阴性血清50份均来源于临床和实验室确诊人群，健康人群血清50份来源于全国乙肝流行病调查人群。

1.2基因合成 按图1所示排布氨基酸序列，并根据大肠埃希菌偏好密码子表进行基因优化，并在5'端引入NdeI酶切位点，3'端引入XhoI酶切位点，TRX与抗原表位之间引入NcoI酶切位点，抗原表位与2×BSP之间引入HindIII酶切位点，XhoI酶切位点前引入“TAA”终止密码子，交由日本TaKaRa公司合成，基因片段大小为954 bp，命名为H32。

1.3表达质粒的构建 基因片段H32人工合成后存于pMD-19T载体上，用限制性内切酶 NdeI和XhoI将目的片段酶切下来（注意：pMD-19T载体固有的XhoI酶切位点，选择大小为954 bp的片段进行回收），连接到相同酶切处理的pET43.1a载体上，转化BL21（DE3）感受态细胞。次日挑取单克隆菌落进行小量表达，提取阳性克隆质粒后进行测序和双酶切鉴定。

1.4目的蛋白的表达和纯化 将新鲜转化H32表达质粒的BL21（DE3）菌液接种（1∶1000）于含氨苄霉素（50 μg/m1）的LB培养基（10 g/1蛋白胨，5 g/1酵母提取液，10 g/1 NaC1）中，32℃振荡培养16 h后等倍扩菌。37℃继续培养2 h后将温度调至37℃，IPTG终浓度0.8 mmo1/L诱导3 h后离心收菌（3，000 g，10 min，4℃）。普通裂解液（10 mmo1/L Tris-HC1，0.5%Triton X-100，pH 8.0）重悬菌体沉淀后超声破碎，离心（174，000 g，10 min，4℃）收集上清。上清中加入终浓度为500 mmo1/L的NaC1后上样于用基液I（10 mmo1/L Tris-HC1，pH 8.0）平衡的Che1ating Sepharose Fast F1ow层析介质中。待上样完毕，用 0 mmo1/L、30 mmo1/L、60 mmo1/L、300 mmo1/L咪唑（溶于基液I中）进行梯度洗脱，并收集相应洗脱液。分别取样SDS-PAGE观察目的蛋白的含量以及分布情况，将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于基液I中进行彻底透析备用。DEAE Sepharose Fast F1ow层析介质用基液I平衡后将透析液上样，待上样完毕，用0 mmo1/L、100 mmo1/L、200 mmo1/L、400 mmo1/L NaC1（溶于基液I中）进行梯度洗脱并收集相应洗脱液。分别取样SDS-PAGE观察目的蛋白的含量以及分布情况。将目的蛋白含量最高，纯度最好的洗脱液于PBS中彻底透析后，加入终体积为20%甘油，于-20℃保存。

1.5目的蛋白的鉴定 利用Western B1ot技术对H32抗原性进行初步鉴定。将最终纯化的H32上样13.5%SDS-PAGE进行电泳，恒流40 mA，45 min后进行半干转膜至硝酸纤维素膜（NC）（恒压15 V，30 min）上。封闭液（含5%脱脂奶粉的PBST）处理NC膜（过夜，4℃），次日分别加入封闭液稀释的Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，mouse anti-Rube11avirusE1monoc1ona1antibody以及Streptavidin-HRP（1∶500）作为捕获抗体，常温孵育1 h后用PBST洗膜5次。检测抗体分别为封闭液稀释的兔源，鼠源二抗-HRP（1∶5000），常温孵育1 h 后PBST洗膜5次，最后DAB显色，清水终止显色。

1.6目的蛋白诊断效能的评价 利用H32诊断抗原来建立风疹病毒血清IgM抗体诊断ELISA试剂盒，并对临床和实验室确诊的血清样本进行检测，评价试剂盒对阴阳性血清标本的鉴别能力。简单而言，碳酸盐包被缓冲液稀释抗μ-二抗后封闭液封闭非特异性位点；加入检测血清（1∶10稀释），置37℃孵育1 h，然后洗涤；加入H32蛋白（1∶1000稀释），置37℃孵育1 h，然后洗涤；加入Streptavidin-HRP（1 ∶2000稀释），置37℃孵育1 h，然后洗涤；加入A、B液显色，用酶标仪在450 nm和630 nm下测定各孔吸光度值（A值）。

2 结果

2.1目的蛋白的构建与表达纯化H32的构建 如图1.A，目的蛋白的氨基端带有His标签，紧跟着是硫氧还蛋白前缀，然后是RV-E1，后缀为BSP二倍体，间隔中添加了必要的限制性酶切位点，方便以后进行表达质粒的改造。双酶切处理（NdeI和XhoI）pET43.1a载体和H32全基因合成片段获取带有相同粘性末端的载体（约5500 bp）和片段（约954 bp）（图2.B），经过连接转化入感受态细胞后提取质粒，测序和双酶切鉴定结果（图1.C）显示目的片段已经成功插入表达质粒中，并将正确质粒命名为H32质粒。

A H32构建示意图；B双酶切处理获取载体（泳道1）和片段（泳道2）；C H32表达质粒的双酶切鉴定（泳道3 NdeI-XhoI）图1　H32表达质粒的构建A Schematic diagram of H32 construction；B Doub1e-enzyme dea1ing with vector（1ane 1）and fragment（1ane 2）；C Restriction endonuc1ease ana1ysis of the expression p1asmid（1ane 3，NdeI⁃XhoI）Fig.1 The construction of H32 expression p1asmids

1.阴性对照；2-9.8个阳性单克隆菌落；10.全菌；11.沉淀；12.上清；13.穿柱；14.60 mmo1/L咪唑洗脱液；15.300 mmo1/L咪唑洗脱液；16.200 mmo1/L NaC1洗脱液图2　H32蛋白小量表达（A），亲和纯化（B）及阴离子交换纯化结果（C）Lane 1，negative contro1；1ane 2-9，expression of 8 sing1e-co1onies；1ane 10，tota1 bacteria1 proteins after sonication；1ane 11，so1ub1e fraction of the homogenate；1ane 13，f1ow-through；1ane 14，e1utes washed with 60 mmo1/L imidazo1e；1ane 15，e1utes washed with 300 mmo1/L imidazo1e；1ane 16，e1utes washed with 200 mmo1/L NaC1Fig.2 The prokaryotic expression（A）and purification of H32 protein by affinity（B）and DEAE chromatography（C）

挑取8个新鲜转化H32质粒的BL21（DE3）单克隆菌落培养适当时间后进行诱导表达，SDS-PAGE电泳结构发现，对比对照组，在约40 kDa处有明显表达条带（图2.A），而实际的目的蛋白大小约为35 kDa。经查阅文献发现目的蛋白中大量碱性氨基酸的存在，让目的蛋白大小在电泳图上表现为偏大，因此40 kDa目的条带处即为H32蛋白，表明H32蛋白可以在大肠埃希菌中有效表达。大量表达后发现目的蛋白主要存在于超声菌体沉淀重悬液的上清中（图2.B），目的蛋白含量达到36.17%。将上清液进行处理后利用His亲和层析进行纯化，电泳结果发现目的蛋白主要存在于300 mmo1/L咪唑洗脱液中（图2.B），并且目的蛋白含量达到了87.21%，浓度为2.2 mg/m1。300 mmo1/L咪唑洗脱液经过完全透析后，上DEAE阴离子交换层析柱，电泳结果发现目的蛋白主要分布于200 mmo1/L NaC1洗脱液中，并且目的蛋白的含量达到了95.31%，浓度为2.1 mg/m1。最后将200 mmo1/L NaC1洗脱液在PBS中进行完全透析，加入终浓度为20%的甘油后-20℃保存。

2.2目的蛋白的鉴定 根据目的蛋白中包含硫氧还蛋白、RV-E1表位以及 BirA酶底物等特征，对H32蛋白的抗原性进行初步鉴定。Western B1ot结果显示，利用针对RV-E1抗原表位的单克隆抗体作为捕获抗体，在NC膜上相应位置可以出现目的条带（图3.A）；直接利用生物素配体链霉亲和素偶联HRP作为捕获抗体和检测抗体，NC膜上相应位置也可以出现目的条带（图3.B）；利用针对硫氧还蛋白抗原表位的单克隆抗体作为捕获抗体，在NC膜上相应位置同样可以出现目的条带。表明了H32蛋白包含了硫氧还蛋白、RV-E1抗原表位、以及共价结合了生物素的BSP。

A捕获抗体为mouse anti-Rube11a virus E1 monoc1ona1 antibody，检测抗体为鼠源二抗-HRP；B捕获抗体和检测抗体为Streptavidin-HRP；C捕获抗体为Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody，检测抗体为兔源二抗-HRP图3　H32的Western B1otting分析A Mouse anti-Rube11a virus E1 monoc1ona1 antibody as capture antibody；mouse anti-IgG-HRP as detection antibody；B Streptavidin-HRP as capture and detection antibody；C Rabbit anti-Thioredoxin po1yc1ona1 antibody as capture antibody；rabbit anti-IgG-HRP as detection antibodyFig.3 Western B1otting ana1ysis of H32 protein

2.3目的蛋白诊断效能的评价 利用H32蛋白作为诊断抗原、生物素-亲和素系统为依托建立的风疹病毒IgM抗体检测ELISA试剂盒，分别对50份阳性血清、阴性血清和健康人群血清样本进行检测。从图4可以看出，阳性血清样本与阴性血清样本、健康人群血清样本A值分布明显不同（P＜0.01），而阴性血清样本与健康人群血清样本A值分布无明显区别（P＞0.05）。可以得出，新型风疹病毒IgM抗体诊断试剂盒可以很好地鉴别阴阳性血清样本。

图4　H32抗原诊断效果评价Fig.4 The eva1uation of the diagnostic effect of H32

3 讨论

生物素-亲和素系统是一种生物反应放大系统。生物素广泛分布于动植物组织中。活化的生物素抗原在蛋白质交联剂的介导下，可以与几乎所有已知的生物大分子偶联，包括蛋白质、核酸、多糖、脂类等。本研究为确保原核表达体系中充足的生物素分子，添加了生物素入表达体系，确保每个新表达的目的蛋白分子都偶联了充足的生物素。亲和素亦称抗生物素蛋白、软白素，是从软白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白。生物素与亲和素在作用是目前已知强度最高的非共价键作用，结合稳定性好专一性强。本实验中ELISA检测方法将链霉亲和素-HRP偶联物与RV-E1-亲和素组成检测复合物，依托生物素-亲和素系统建立而成。此方法有效避免了由于HRP偶联诊断抗原带来的抗原效价降低或失活，偶联反应只涉及链霉亲和素，有效提高了针对不同病毒的检测方法的稳定性和可重复性。构建中（图1.A）包含连续重复BSP序列目的是确保BirA酶的准确定位识别，原核表达体系中生物素分子的添加是增加目的蛋白的生物素化程度，WB实验（图3.B）以及ELISA检测实验证实了生物素化RV-E1的稳定性以及此生物素-亲和素系统在ELISA检测中的实用性。

硫氧还蛋白作为融合蛋白前缀有效提高目的蛋白在原核表达系统中表达量的同时（图2.B），也在一定程度上增强了目的蛋白的可溶性表达。目前尚未研究证明是否生物素化反应与原核系统中蛋白表达过程同时发生，在这种情况下目的蛋白的可溶性对于生物素化反应是至关重要的。本研究所制备的生物素-RV-E1诊断抗原是可溶性的，避免了由于包涵体的形成破坏了生物素化反应的发生。下一步研究将集中于生物素化反应的空间和时间问题。另外ELISA构建中，下一步研究将集中于进行诊断抗原与链酶亲和素-HRP的配比实验，即酶结合物的制备方案，这样可以使检测工作更加快捷省时。

我们通过在RV-E1抗原氨基端添加BirA酶最小底物连续重复序列，让其在富含BirA酶的原核表达细胞中进行表达，成功获取了自发生物素化的诊断抗原，并将其应用于风疹病毒感染早起诊断，证实了此生物素-亲和素系统在ELISA检测技术中的可用性，很好地解决了风疹病毒抗原在偶联HRP过程中造成的抗原失活或抗原效价降低，并且为其他病原体检测方法的建立提供了一条广谱技术路线。

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The preparation of recombinant Rubella virus E1 diagnostic antigen biotinylated spontaneously

SuQiudong，Guo Minzhuo，Qiu Feng，Jia Zhiyuan，Lu Xuexin，Meng Qingling，Tian Ruiguang，Gao Yan，Bi Shengli，Yi Yao National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China（Su QD，Qiu F，Jia ZY，Lu XX，Meng QL，Tian RG，Gao Y，Bi SL，Yi Y）Inspection and Quarantine Technical Centre of Beijing Entry⁃exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China（Guo MZ）

Yi Yao，Email：yyao112@163.com

ObjectiveTo prepare recombinant Rube11a virus E1（RV-E1）biotiny1ated spontaneous1y and eva1uate its antigenicity pre1iminari1y.Methods With 2×BSP sequence in the C-termina1 and thioredoxin（TRX）in the N-termina1，aa 148-295 of RV-E1 was expressed in Escherichia coli （E.coli）and purified by affinity and anion exchange chromatography；using biotiny1ated RV-E1，we constructed and eva1uated a nove1 ear1y diagnostic ELISA for Rube11a virus based on biotin-avidin system. Results The so1ub1e biotiny1ated RV-E1 antigen with high homogeneity was obtained；the target protein cou1d bind with monoc1ona1 antibodies for RV-E1 and TRX antigens justified by WB ana1ysis，and streptavidin-HRP conjugate by ELISA ana1ysis；by testing 50 positive and negative sera of Rube11a virus infection and 50 hea1thy peop1e serum，the nove1 ELISA disp1ayed the exce11ent consistency.Conclusions The recombinant RV-E1 carrying BSP cou1d cova1ent1y bind biotin mo1ecu1es spontaneous1y in E.coli，which，as a nove1 diagnostic antigen，cou1d be app1ied for sero1ogica1 detection of Rube11a virus ear1y infection based on biotin-avidin system.

BirA enzyme substrate（BSP）；Rube11a Virus E1 antigen（RV-E1）；prokaryotic expression；biotiny1ated antigen

伊瑶，Emai1：yyao112@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.031

2015-08-08）