两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中的应用

邹晓辉 赵翔 冯兆民 王大燕 舒跃龙

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫计委医学病毒和病毒病重点实验室

两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中的应用

邹晓辉 赵翔 冯兆民 王大燕 舒跃龙

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫计委医学病毒和病毒病重点实验室

目的 评估两种等温扩增方法在二代测序（Next generation sequencing，NGS）病毒鉴定中的应用，为利用二代测序进行病毒鉴定提供参考。方法 选取了两份病原已知的重症肺炎病人咽拭子，分别采用单引物等温扩增（Sing1e primer isotherma1 amp1ification，SPIA）和多重置换等温扩增（Mu1tip1e disp1acement amp1ification，MDA）的方法进行反转录扩增。扩增产物进行NGS测序和宏基因组学分析。结果 SPIA扩增产物片段较短，扩增效率较低；而MDA扩增的产物片段较长，扩增效率也高。SPIA法在两份样本中均检测到目标病原，且目标病原基因组覆盖度较高。MDA在其中一份样本中未能检测出目标病原。结论 SPIA与MDA扩增方法均可用于NGS病原鉴定。SPIA法扩增效率较低，成本较高，但检测病原的能力高于MDA。

【主题词】 等温扩增；下一代测序；病原鉴定

Fund program：Chinese Nationa1 Key Program of Mega Infectious Disease of the Nationa1 12th Five-Year P1an（2014ZX10004002）

近年来，下一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）得到了飞速发展，极大的促进了其在公共卫生领域的应用［1］。NGS技术结合高灵敏度的核酸扩增，可以极大的提高临床实验室发现病原的能力。目前，NGS越来越多的用于临床实验室病原鉴定，并取得了一系列成果［2］。NGS技术已经成为临床病原鉴定的一种重要技术手段，得到了各个国家的高度重视［3］。

单引物等温扩增（sing1e primer isotherma1 amp1ificatio，SPIA）［4］和多重置换扩增（Mu1tip1edisp1acement amp1ification，MDA）［5］是近年来发展较好的两种等温扩增技术。本研究利用两份病原已知的临床样本来评估两种等温扩增方法在临床病原鉴定中的应用，为临床利用NGS技术发现病原提供了参考。

1 材料与方法

1.1样本信息 两份咽拭子样本均来自临床重症肺炎病人。RT-PCR方法鉴定样本A为冠状病毒229E（Coronavirus-229E）和 副流感病毒 2型（Parainf1uenza virus 2，PIV2）两种病毒混合感染；样本B为鼻病毒（Rhinovirus，RnV）感染。咽拭子采集后保存于病毒采样液中，保存于-80℃备用。

1.2样本核酸提取和扩增 样本RNA采用德国Qiagen公司的 RNeasy Mini Kit试剂盒提取，并用NEB公司DNase I消化宿主DNA。RNA采用文献中介绍的SPIA［6］和MDA［7］法进行等温随机扩增。扩增产物采用 Qiagen公司 MinE1ute Reaction C1eanup Kit纯化。扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，产物浓度用Life techno1ogies公司的Qubit® dsDNA HS分析试剂盒定量。

1.3二代测序及数据分析 等温扩增产物采用Ion Torrent PGM（平均读长为200 bp）或I11umina MiSeq （PE250）测序。NGS数据采用 CLC genomics workbench 7.5软件进行分析。首先将100 bp以下和质量值（Phred qua1ity score）低于20的reads去除，剩余的reads进行de novo组装。取片段长度超过500 bp的Contig进行NCBI nr数据库BLAST。取BLAST检索到的病毒基因组为参考基因组进行mapping比对。

2 结果

2.1SPIA与MDA扩增效率比较 取5 μ1 SPIA 与MDA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示，SPIA扩增产物主要分布在200～500 bp之间，条带亮度较小；而MDA扩增的产物大部分均大于2 000 bp，且条带较亮，扩增效率高 （图1）。DNA定量结果显示，SPIA扩增产物量为400～600 ng，而MDA扩增产物量为5～8 μg。

图1　SPIA与MDA扩增两份临床样本（A和B）产物电泳分析Fig.1 Ge1 e1ectrophoresis of amp1ification products from SPIA and MDA（Samp1e A and B）

2.2两种等温扩增方法对目标病毒的鉴定 两份样本RNA通过SPIA和MDA扩增后进行二代测序，共获得了178 814～3 565 305 reads（表1）。对于样本A的两种病毒229E和PIV2，SPIA分别组装出4和15条相应的contig，并分别获得了116和11 102条相应病毒 reads；而MDA未能组装出229E的contig，但获得了21条229E的reads。对于样本B，SPIA扩增可组装出1条长达2 747 bp的contig，并获得139 reads，而MDA未能发现目的病毒RnV的contig和reads。在各个样本中，SPIA匹配上的各个病毒的reads数目明显高于MDA。

2.1两种检测方法覆盖度的分析 为了进一步观察SPIA和MDA两种扩增方法对病毒基因组覆盖度的影响，我们对样本A中的两种病毒进行了病毒基因组覆盖度分析（表2）。结果显示，对于229E病毒，SPIA可获得12.2%的基因组覆盖，MDA只覆盖了7.4%的基因组区域。对于PIV2病毒，SPIA可获得86.7%的基因组覆盖，且大部分区域覆盖深度高于5×；而MDA覆盖了79.60%的区域，且大部分区域覆盖度低于5×。

3 讨论

临床样本由于采集量受限，在进行NGS测序时一般需先进行核酸扩增，特别是拭子类的样本，病毒含量较低，直接提取的核酸量一般不能满足NGS的测序的最低起始量要求，因此，测序之前进行核酸扩增是NGS测序的常规步骤。传统的PCR扩增容易造成模板扩增的偏移，不利于后续的检测。等温扩增技术具有较好的均一性，在近年来得到了越来越多的应用［8］。本研究利用咽拭子样本，比较近年来发展较快的两种等温扩增方法在NGS病原检测上的应用，为临床实验室开展NGS病原检测提供了方法学参考。

RT-PCR是现阶段临床检测病原微生物的主要手段［9］，而 NGS技术在近年来使用越来越多［10］。本研究比较了这两种比较成熟的等温扩增技术在NGS病原鉴定中的应用，结果显示在两份临床样本中，SPIA检测到病原的能力均高于MDA扩增，但其扩增效率较低。本研究的MDA和SPIA扩增均未能获得病毒的全基因组序列，这可能与测序数据中的宿主基因组成分过高有关。通过样本预处理的方法去除宿主基因组成分，并加大测序的数据量，可以有效提高基因组的覆盖度。

表1　SPIA和MDA扩增产物病毒分布Tab.1 Virus identified from the SPIA and MDA product using NGS

表2　SPIA和MDA扩增产物目标病毒覆盖度分析（样本A）Tab.2 Coverage ana1ysis of the two virus in samp1e A amp1ified by SPIA and MDA

总之，本研究比较了SPIA和MDA两种等温扩增方法在NGS病原检测上的应用。SPIA与MDA均具有检测病原的能力，但SPIA用于NGS病原检测的能力高于MDA。在今后的使用中，可以根据测序平台、测序成本和测序通量选择合适的扩增方法。

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Application of two isothermal amplification methods in pathogen identification using the next generation sequencing

Zou Xiaohui，Zhao Xiang，Feng Zhaomin，Wang Dayan，Shu YuelongNatonal Influenza Center，National Institute for Viral Disdease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory for Medical Virology，National Health and Family Planning Commission，Beijing 102206，China

Shu Yuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

Objective This study eva1uated two isotherma1 amp1ification methods for their abi1ity to identify targeted virus in the c1inica1 samp1es，which provided a reference for other researchers using NGS in c1inica1 diagnostics.Methods Nasopharyngea1 swabs from two patients with severe pneumonia were amp1ified with Sing1e Primer Isotherma1 Amp1ification（SPIA）method and Mu1tip1e Disp1acement Amp1ification （MDA）approaches and further proceeded to NGS and metagenomics ana1ysis to identify targeted virus. Results The SPIA produced shorter fragments than MDA，and had a 1ower amp1ification efficiency.The SPIA successfu11y identified targeted viruses in the two c1inica1 samp1es tested，whi1e MDA fai1ed to detect that in one of the samp1es.Conclusions Both SPIA and MDA cou1d be app1ied to pathogen identification using NGS in the c1inica1 diagnostics.SPIA possessed 1ower amp1ification efficiency and higher economic cost，but had higher capacity to discover the causing agents in the c1inica1 samp1e.

Isotherma1 amp1ification；Next generation sequencing；Pathogen identification

“十二五”重大传染病专项“人感染新型流感防控技术研究（2014ZX10001002）

舒跃龙，Emai1：yshu@cnic.org.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.029

2016-01-05）