偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR的建立及应用

周杰英 林应标 曹友德 段招军

423000郴州，湖南省郴州市第一人民医院（周杰英，林应标）；410005长沙，湖南省人民医院（曹友德）；100050北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（段招军）

偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR的建立及应用

周杰英 林应标 曹友德 段招军

423000郴州，湖南省郴州市第一人民医院（周杰英，林应标）；410005长沙，湖南省人民医院（曹友德）；100050北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（段招军）

目的 建立偏肺病毒逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR），并检测临床样本，了解偏肺病毒感染患儿的临床流行病学特点。方法 针对保守基因F合成引物和探针，制备偏肺病毒转录RNA标准品并建立标准曲线，检测线性范围、最低检测限、重复性、灵敏度和特异性。对采集自2010年12月至2011年11月兰州地区急性呼吸道疾病患儿的222份下呼吸道临床标本进行偏肺病毒筛查，同时对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查，并对偏肺病毒进行相关流行病学分析。结果 方法线性检测范围是10-108拷贝/μ1，最低检测限是10拷贝/μ1，曲线相关系数是1，扩增效率是91.62%，Ct值组内CV值小于2%。以传统PCR产物的测序结果为参照，逆转录实时荧光定量PCR的敏感性和特异性分别是100%和96.17%。偏肺病毒检出22例（9.46%），其中男童13例（5.86%），女童8例（3.60%）。春、夏、秋、冬的检出率分别是15.71%、0%、5.08%、11.11%。偏肺病毒载量与混合感染、疾病种类、临床症状差异均无统计学意义。结论 该方法是检测偏肺病毒灵敏度、特异性和重复性均较好的方法；偏肺病毒在兰州地区儿童呼吸道感染中占有重要地位，长期系统的监测具有重要意义。

【主题词】 逆转录实时荧光定量PCR；偏肺病毒

人偏肺病毒（HMPV），2001年由荷兰学者Vanden Hoogen等［1］首次从儿童呼吸道感染标本中分离，对所有年龄阶段的个体均易感，能够引起发烧、咳嗽、喘息、气促、气喘和寒颤［2］等症状，尤其在幼儿、老年人、免疫功能缺陷和器官移植患者中可以引起严重的呼吸道感染性疾病。人偏肺病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科偏肺病毒属，是具有包膜包裹的RNA病毒，病毒基因组长13kb，包含有9个开放阅读框架和8个基因，编码9个蛋白质，分别为：P

蛋白，N蛋白，M蛋白，F蛋白，G蛋白，L蛋白，M2-1，M2-2，SH蛋白［3，4］。近些年来，逆转录实时荧光

PCR已经成功运用于实验室偏肺病毒检测中，显著提高了偏肺病毒的检测效率。本研究以兰州12岁以下急性呼吸道感染住院患儿为研究对象，应用逆转录实时荧光PCR检测偏肺病毒并进行相关流行病学统计学分析，这对偏肺病毒的检测和控制具有科研和监测的双重意义。

1 材料与方法

1.1标本来源 样本来自2010年12月至2011年11月甘肃兰州某医院222份急性呼吸道疾病患儿的下呼吸道临床标本。患者年龄从1天至12岁，男性133例，女性89例。临床诊断包括：急性支气管肺炎98例，急性喘息性支气管肺炎85例，急性上呼吸道感染9例，新生儿肺炎9例，大叶性肺炎7例，哮喘3例，急性化脓性扁桃体炎2例，迁徙行支气管炎2例，支气管哮喘2例，急性疱疹性咽峡炎2例，迁延性支气管炎1例，多脏器功能竭1例，重症肺炎1例。

1.2试剂及仪器 偏肺病毒阳性标本由中国疾病控制中心惠赠；DH5ɑ感受态细胞购于日本TaKaRa公司，T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自美国NEB公司；体外转录和RT-PCR试剂盒购自美国App1ied Biosystems公司；PCR产物纯化、质粒提取及核酸双提试剂盒购自德国 Qiagen公司。美国 App1ied Biosystems公司的Stepone p1us扩增仪。

1.3引物和探针 引物及探针序列：HMPVF：CAA GTG TGA CAT TGC TGA YCT RAA；HMPVR：ACT GCC GCA CAA CAT TTA GRA A；HMPVPb：TGG CYG TYA GCT TCA GTC AAT TCA ACA GA［2］，扩增目的片段长78 bp，位于人偏肺病毒F基因段。

1.4偏肺病毒反应体系及条件 反应体系：10 μ1缓冲液，0.8 μ1酶混合液，3.6 μ1水，引物各（20 μmo1/L）0.4 μ1，探针（10 μmo1/L）0.4 μ1，模板4.4 μ1。50℃反转录30 min，95℃预变性10 min，95℃ 变性15 s和60℃退火延伸30 s，共40个循环并采集荧光信号。

1.5体外转录RNA标准品的构建 将提取的偏肺病毒核酸RNA进行逆转录PCR扩增，将扩增产物进行割胶纯化，其纯化产物与含有T7启动子的pGEM-T载体4℃孵育18 h进行连接，连接产物与感受态大肠埃希菌DH5α转化构建质粒，将转化的大肠埃希菌DH5α涂布于含有Amp/IPTG/X-ga1的LB培养平板上，37℃孵育12 h，挑取阳性克隆增菌、抽提质粒及测序，37℃孵育2 h进行酶切（PUVⅡ酶）获得相应的DNA片段，体外转录及RNA纯化使用Mega Sript T7 invitro transription及Mega C1ear kit试剂盒，纯化后的RNA使用核酸蛋白测定仪测定吸光度值，纯度A260/A280比值在1.8-2.0间符合要求的RNA作为偏肺病毒RNA标准品。

1.6临床评价和流行病学分析 传统PCR产物的测序结果证实为目的基因的即为阳性，否则为阴性，以此为标准，对实时荧光定量逆转录PCR结果进行灵敏度和特异度分析。结合病例资料对偏肺病毒的流行病学进行相关统计学分析。

1.7统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学处理分析。

2 结果

2.1荧光RT-PCR灵敏度分析 将偏肺病毒RNA标准品进行10倍稀释，在病毒载量10～108拷贝/μ1内进行荧光定量PCR反应，构建标准曲线，曲线相关系数是1，扩增效率是91.62%，说明本方法在10 ～108拷贝/μ1浓度范围内有很好的线性相关性。偏肺病毒线性范围检测下限是10拷贝/μ1。更低的浓度（10-1拷贝/μ1）能够被检测到，但并不是所有的重复（6次）都能够被检测到，所以不能认为10-1拷贝/μ1是最低的检测限［4］。

2.2荧光RT-PCR特异性分析 建立的偏肺病毒逆转录实时荧光定量方法与鼻病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、博卡病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型、偏肺病毒、副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型、甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒（NL63，HKU1，OC43，229E）阳性核酸均无特异性扩增曲线，说明了偏肺病毒与这些病毒无交叉反应，证明了偏肺病毒的引物和探针具有较高的特异性。

2.3荧光RT-PCR扩增曲线的重复性 选择104-108拷贝/μ1 5个浓度梯度做6个重复，计算变异系数。偏肺病毒Ct值的变异系数均小于2%，说明相同浓度的Ct值离散程度小，重复性好，结果可靠。

2.4偏肺病毒荧光RT-PCR临床评估分析 传统PCR测得的13份偏肺病毒阳性标本和209份阴性标本，偏肺病毒荧光RT-PCR将13份阳性标本全部检出，并从209份阴性标本检出8份，说明两种方法有较好的符合率，且RT-PCR方法的灵敏度比传统PCR高。传统PCR产物的测序结果证实为目的基因的即为阳性，否则为阴性，以此为判断标准，偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR的敏感性和特异性分别是100%和96.17%。说明偏肺病毒逆转录实时荧光定量PCR具有较好的灵敏度和特异性。

2.5偏肺病毒流行病学分析 在222份急性呼吸道疾病患儿的下呼吸道临床标本共检出偏肺病毒感染的小儿呼吸道患者21例，其中男童 13例（5.86%），女童8例（3.60%），总检出率为9.46%。男女童偏肺病毒检出率差异无统计学意义（χ2= 0.32，P＞0.05）。偏肺病毒阳性的标本进行其他呼吸道病毒的筛查，合并感染呼吸道合胞病毒（7例）、副流感Ⅲ病毒（5例）、腺病毒（4例）、副流感病毒（3例）、乙型流感病毒（1例）、博卡病毒（1例）。可见，偏肺病毒感染的小儿呼吸道患者中合并感染位于前三位的分别是呼吸道合胞病毒、副流感病毒和腺病毒。春、夏、秋、冬的检出率分别是 15.71%（11/ 70）、0%（0/32）、5.08%（3/59）、11.11%（7/63），偏肺病毒检出的季节分布结果见图1。将春夏秋冬四季偏肺病毒阳性率进行多组率和两组间率的比较，春、秋、冬三季偏肺病毒阳性率高于夏季阳性率。兰州地区急性呼吸道疾病患儿感染偏肺病毒多发生在春、冬两季，其次为秋季。

21份阳性标本的 Ct均值是 24.71（15.52-32.24），所检出的最大载量为1.5×106拷贝/μ1，最小载量为1.2×101拷贝/μ1，平均载量为1.2×105拷贝/μ1。从混合感染的角度分析，偏肺病毒RNA载量在102拷贝/μ1及以上和以下的差异无统计学意义；从疾病种类（上呼吸道疾病、支气管炎、喘息性支气管炎、肺炎）分析，偏肺病毒RNA载量在102拷贝/μ1及以上和以下的差异无统计学意义；从临床症状（发热、喘息、气促、气喘）分析，偏肺病毒RNA载量在102拷贝/μ1及以上和以下的差异无统计学意义。

3 讨论

偏肺病毒引起的临床症状和隶属肺病毒属的呼吸道合胞病毒相似，可以引起上呼吸道感染性疾病、严重者可导致肺炎［1］、毛细支气管炎及喘息性肺炎。偏肺病毒与肺部疾病及慢性阻塞性肺炎有相关性，在病毒感染的3～5 d可以引起间质性肺炎或者肺泡炎，2～3周后会引起细支气管炎［5］。本研究在21例偏肺病毒感染患儿中，有9例患儿诊断为喘息性支气管炎，提示偏肺病毒可能是引起儿童急性喘息的病原体之一。偏肺病毒感染主要发生在春冬季［6，7］，与本研究的偏肺病毒感染主要发生在春、冬季一致。男女童偏肺病毒检出率差异无统计学意义。兰州地区2010年12月至2011年11月偏肺病毒检出率（9.46%）稍低于兰州2011年 12月至2012年11月检出率（12.14%）［8］（均采用逆转录实时荧光定量PCR检测），但高于传统PCR方法检测兰州地区2006-2009年偏肺病毒检出率（0.4%-7.1%）［9-11］，检出率的高低可能与检测方法的灵敏度有关。在合并感染的分析中，发现合并腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒的情况较多，这与以前的研究相一致，进一步说明了腺病毒、呼吸道合胞病毒、博卡病毒是引起儿童呼吸道疾病的常见病毒。另外，本研究进行了疾病病毒载量和感染疾病种类和临床特征的相关性研究，偏肺病毒载量和混合感染、疾病种类、临床症状差异无统计学意义。由于本研究实验数据有限，所以需要更多的研究来探讨病毒载量和病情严重关系。偏肺病毒的检测和控制具有科研和监测的双重意义，目前HMPV感染临床的快速诊断以及相关的血清学研究还非常欠缺。鉴于HMPV在下呼吸道感染占有重要的地位，需加强对该病毒的系统的流行病学监测。

图1　偏肺病毒检出季节分布Fig.1 Month1y distribution of Metapneumovirus infection

与传统PCR方法相比较，逆转录实时荧光定量PCR技术具有能够定量，检测线性范围宽、灵敏度高、特异性高、重复性好及快速简单等优点。尽管实时荧光PCR获得的阳性结果和现有知识并不完全一致，但是这种敏感的方法至少让我们获得了更多的经验，我们有可能发现新病原或者以前没有发现的病原［11］。本研究探针标记选择FAM/BHQ标记，BHQ作为淬灭基团具有无本底荧光的特点，与本身发光的TAMRA淬灭基团相比，BHQ具有提高检测灵敏性的优势。

本研究成功建立和估以偏肺病毒为模板的RTPCR定量方法，具有灵敏度高、特异性好及重复性好的优点，是检测偏肺病毒快速有效的方法，HMPV在儿童下呼吸道感染中也占有重要的地位，因此逆转录实时荧光定量方法在临床早期诊断和疾病的监测、预防领域有较好的应用前景。

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Establishment and application of Real-time quantitative PCR for human Metapneumovirus detection

Zhou Jieying，Lin Yingbiao，Cao Youde，Duan Zhaojun The First People's Hospital of Chenzhou，Chenzhou 423000，China（Zhou JY，Lin YB）；Hunan Provincial People′s Hospital，Changsha 410005，China（Cao YD）；National Institute for Viral Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China（Duan ZJ）.

Cao Youde，Email：youde120@aliyun.com；Duan Zhaojun，Email：zhaojund@ 126.com

Objective To estab1ish and eva1uate a Metapneumovirus rea1-time quantitative reverse transcription po1ymerase chain reaction（RT-PCR），detect c1inica1 specimens and exp1ore the c1inica1 preva1ence characteristics of Metapneumovirus-infected chi1dren.Methods The primers and probes which targeted the conserved genes F were designed，RNA standards were prepared to estab1ish a standard curve，the sensitivity，specificity and reproducibi1ity had been tested.222 1ower respiratory c1inica1 specimens were co11ected from chi1dren in Lanzhou area with ARI.Metapneumovirus and co-infection viruses were detected simu1taneous1y；further Metapneumovirus re1ated epidemio1ogy was studied.Results Metapneumovirus 1inear detection range was 10-108copies/μ1，the 1owest detection 1imit was 10 copies/μ1，the corre1ation coefficient was 1，the amp1ification efficiency was 91.62%，the CV of Ct va1ue was 1ess than 2%.Take conventiona1 PCR product sequence resu1ts as reference，rea1-time quantitative RT-PCR sensitivity and specificity were 100%and 96.17%.Metapneumovirus detection rate were 9.46%，13 cases for boys （5.86%），8 case for gir1s（3.60%）.The detection rate of spring，summer，autumn and winter were 15.71%，0%，5.08%，11.11%.There were no significant differences between the Metapneumovirus vira1 1oad and mixed infection or the types of disease，c1inica1 symptoms.Conclusions Metapneumovirus rea1-time quantitative RT-PCR has been confirmed as a sensitive and specific method.Metapneumovirus was an important agent of chi1dren respiratory tract infection in Lanzhou region.We shou1d take the 1ong-termsystematic survei11ance serious1y.

Rea1-time quantitative reverse transcription PCR；Metapneumovirus

曹友德，Emai1：youde120@a1iyun.com；段招军，Emai1：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.026

2015-12-18）