儿童呼吸道感染标本人偏肺病毒的分子检测与分型

寇宇 于新芬 李钧 杨旭辉 周银燕 潘劲草 谢立 孙昼 濮小英 陈树昶

310021杭州市疾病预防控制中心微生物检验科

儿童呼吸道感染标本人偏肺病毒的分子检测与分型

寇宇 于新芬 李钧 杨旭辉 周银燕 潘劲草 谢立 孙昼 濮小英 陈树昶

310021杭州市疾病预防控制中心微生物检验科

目的 了解儿科门诊流感样病例和住院严重急性呼吸道感染病例中人偏肺病毒（hMPV）感染状况、病毒基因特征。方法 选取2011-2013年杭州地区哨点医院，儿科呼吸道门诊、住院病例共2 593例，流感样病例采集咽拭子1 676份，住院重急性呼吸道感染病例采集气管吸取物917份。用实时荧光RT-PCR方法检测hMPV核酸，阳性样本用RT-PCR方法对hMPV融合蛋白（F）基因片段扩增、序列与基因分型。实验结果作描述性统计和样本率的卡方检验。结果 门诊检出率6.62%（111/1 676），住院检出率6.32（58/917），检出率差异无统计学意义（χ2=0.086，P=0.769）。门诊与住院hMPV性别检出率差异无统计学意义。 ＜1岁组住院患儿检出率（6.33%，43/679）高于门诊（2.79%，19/681），差异有统计学意义（χ2=9.808，P=0.002）。hMPV阳性患儿平均年龄门诊（31.33±18.50月）＞住院（10.41±8.28月）。冬季门诊检出率13.56%（59/435）高于住院8.06% （20/248），差异有统计学意义（χ2=4.669，P=0.031）。hMPV共感染检出率住院（31.04%，19/58）高于门诊（18.01%，20/111），差异有统计学意义（χ2=4.663，P=0.031）。门诊和住院hMPV均以A2亚型最多，不同基因型的临床特征不明显。结论 门诊与住院hMPV感染率无差异，hMPV阳性患儿平均年龄门诊大于住院，冬季hMPV检出率门诊高于住院，门诊与住院hMPV共感染主要病原不同，研究期间门诊与住院基因型均以A2为主。

【主题词】 人偏肺病毒；儿童；流感样病例；住院严重急性呼吸道感染病例；分子分型

Fundprograms：ScientificandTechno1ogica1Deve1opmentProgramofChinaHangzhou （20110833B36，20120533Q24）

人类偏肺病毒 （human metapenumovirus，hMPV）是偏肺病毒属的一种呼吸道病毒病原，于2001年首次在荷兰呼吸道疾患儿童的鼻咽分泌物中分离。hMPV感染后可以表现为上、下呼吸道感染［1］，轻者表现为上呼吸道不适、流感样症状，重者为支气管炎和肺炎。在以往的研究中，各国学者都注重对住院患儿下呼吸道人偏肺病毒感染状况［2］、临床特点［3］及病毒分子生物特性研究，对门诊及上呼吸道hMPV感染报道甚少［4］。本研究收集2011-2013年杭州地区儿科呼吸道门诊ILI及住院SARI为研究对象，比较其hMPV感染特征。

1 材料与方法

1.1样本来源 于2011年1月-2013年12月，选取杭州市的2家流感哨点医院为监测点，门诊以流感样病例［5］（inf1uenza-1ike i11ness，ILI）、住院以严重急性呼吸道感染病例［6］（Severe Acute Respiratory Infection，SARI）为研究对象。年龄为14周岁以下儿童共2593例，其中门诊（ILI）1676例、儿科住院（SARI）917例。门诊男性患儿991例，女性685例；住院男性患儿606例，女性311例。ILI＜1岁681例，1～3岁690例，4～6岁196例，7～14岁109例；SARI＜1岁679例，1～3岁173例，4～6岁39例，7 ～14岁26例。ILI患儿平均年龄25.44±20.37月，年龄中位数 12月，SARI患儿平均年龄12.16± 11.26月，年龄中位数6月。由于工作量和实验经费等原因，门诊仅收集每周一、三的就诊当日ILI病例咽拭子样本，住院病例收集当日白天新入院SARI痰液抽取物（或气管吸取物）。全部观察病例只采1次样本，采集后及时填写录入信息，并于24 h内送实验室。样本采集过程均告知患儿家属并征得同意。

1.2实验方法 使用QIAGEN RNeasy Mini Kit试剂盒提取样本病毒总RNA，方法按试剂盒说明书操作，提取基因组RNA-40℃保存。用Rea1-time RTPCR方法检测hMPV，引物、探针、扩增条件均参照参考文献［7］，仪器使用美国ABI公司的Prism 7500型上进行。选择荧光定量RT-PCR检测荧光信号较强、Ct值较小的阳性样本的核酸，用大连宝生物工程技术服务有限公司的日本TaKaRa逆转录试剂盒，以随机六聚体引物逆转录合成cDNA进行传统RT-PCR，检测hMPV融合蛋白（F）基因片段，引物、扩增条件与参考文献［8］一致，目的片段526 bp，符合片段大小的PCR产物经用AxyPrep DNA Ge1 Ext ract ion Kit（Ax ygen，USA）纯化、回收，送上海生物工程公司测序。

1.3其他病毒检测 用实时荧光RT-PCR方法检测流感病毒，引物和探针来自中国疾病预防控制中心，包括A型和B型流感通用引物、季节性H1N1 和H3N2亚型分型引物、甲型H1N1亚型分型引物。反应程序为42℃逆转录15 min后，95℃变性30 s，然后进入45个扩增循环（95℃变性5 s，55℃退火并延伸30 s）。呼吸道合胞病毒引物、探针和反应条件按文献［9］进行。仪器使用美国ABI公司的Prism 7500型扩增仪。

1.4基因分型 采用基因测序分型方法，用DNAStar软件将测序结果与GenBank中公布的多株hMPV的F基因序列进行比对，并用Mega 5.0软件构建进化树。序列分析所用参考序列均来源NCBI 的GenBank（ht tp：//www.ncbi.n1m.nih.gov）注册hMPV病毒株，各亚型参考株登录号：A1：NL00-1 （AF371337），A2a：NL00-17（AY298021）、CAN97-83 （AY297749），A2b：BJ1887（DQ843659）、JPS03-240 （AY530095），B1：NL99-1（AY525842），B2：CAN98-75（AY297748）、BJ1816（DQ843658），禽肺病毒APC（AF579780）。同时将杭州地区hMPV F蛋白核苷序列提交GenBank注册。

1.5统计学方法 用SPSS 16.0软件进行数据整理分析。计量资料采用±s表示，计数资料采用率或构成比（%）表示。其平均年龄和感染率估计描述性统计方法。卡方检验比较两个样本hMPV感率和不同年龄组病毒感染，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1临床表现 本次研究共选择2593份病例，其中门诊1676例ILI，临床主要为流感样症状，发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。住院的917 SARI病例，其中6～14岁40例，临床表现符合流感样症状，主要有呼吸困难、呼吸频率≥25次/min；≤5岁877例临床表现符合流感样症状，主要为气促：呼吸频率大于60次/min（＜2个月的婴儿）、呼吸频率大于50次/min（2～11月龄婴儿）、呼吸频率大于40次/min（1～5岁），临床主要诊断为急性支气管肺炎、毛细支气管炎、迁延性支气管炎等。

2.2感染流行病特点

2.2.1门诊与住院中hMPV检出率：门诊ILI样本hMPV检出率6.62%（111/1676），住院SARI检出率6.32%（58/917），检出率差异无统计学意义（χ2=0.085，P=0.769）。门诊、住院男、女患儿检出率差异无统计意义（χ2=0.287，P=0.592），见表1。

2.2.2门诊与住院病例hMPV年龄组比较：门诊hMPV感染平均年龄为（31.33±18.50）月，住院为（10.41±8.28）月。＜1岁组检出率差异有统计学意义，见表1。hMPV阳性龄组构成，门诊1～3岁组最高占64.86%（72/111），住院 ＜1岁组最高占74.13%（42/58）。

2.2.3门诊与住院病例hMPV感染时间比较：2011 年hMPV门诊呼吸道感染的检出高峰在2～3月，住院hMPV高峰在5～6月；2011-2012年冬门诊流行高峰在11月至次年4月，住院是在12月至次年6月；2012-2013年hMPV门诊流行高峰在11月至次年4月，住院是在12月至次年5月。总体住院儿童hMPV检出流行高峰滞后门诊2个月，见图1，比较门诊与住院hMPV冬季检出率差异有统计学意义，见表1。

2.2.4门诊与住院病例hMPV共感染情况：39份hMPV与流感、呼吸道合胞病毒共混合感染样本中，门诊与住院与2种病毒共感染检出率差异有统计学意义，见表1。门诊hMPV病例主要与INF混合感染占60.00%（12/20），住院hMPV主要与RSV占63.15%（12/19）。

表1　呼吸道门诊与住院患儿hMPV阳性资料的比较Tab.1 A comparison ana1ysis of c1inica1 features of human Metapneumovirus infections between inpatients and outpatients of respiratory tract infections

图1　杭州地区儿科呼吸道门诊和住院病例hMPV检出情况Fig.1 Detection of human Metapneumovirus in chi1dren with respiratory tract infections in Hangzhou area

2.3门诊与住院病例hMPV阳性株基因分型 门诊hMPV阳性测序率为46.84%（52/111），住院hMPV阳性测序率为62.06%（36/58）。连续3年监测杭州呼吸道感染患儿存在2种基因型的4个亚型（A1、A2A、B1、B2），门诊样本未检出A1亚型，住院样本未检出B2亚型。门诊（A：26，B：26）与住院（A：21，B；15）基因型别差异无统计学意义（χ2= 0.594，P=0.441）。

门诊、住院hMPV阳性株基因序列相似性：门诊病例hMPV阳性测序的52株F融合蛋白序列，各基因型与参考株相似性为78.4%～100%，A基因型与参考株相似性为92.9%～99.9%，B基因型与参考株相似性为91.7%～99.8%。住院病例hMPV阳性测序的36株hMPV F融合蛋白序列，各基因型与参考株相似性为81.0%～100%，A基因型与参考株相似性为93.1% ～100%，B基因型与参考株相似性为91.5%～100%。杭州地区的12株hMPV测序结果F融合蛋白部分基因序列已收录GenBank，其中门诊 ILI 6株，编号为 KF729939～KF729944；住院 SARI 6株，编号为 KF729945 ～KF729944。

2.4门诊与住院hMPV基因型别及临床诊断 88株测序的hMPV感染患儿，门诊52例临床表现为发热（体温≥38℃），伴有咳嗽、咽痛之一，由于这部分病例临床症状较轻，主要以高热为主要症状，基因型的临床特征不明显。住院的36例患儿A基因型21例，诊断急性支气管肺炎18例、毛细支气管炎3例；B基因型15例，诊断急性支气管肺炎10例、迁延性支气管炎2例、毛细支气管炎1例、肺炎2例。

患有基础性疾病情况，门诊ILI由于流动性大，未能及时收录相关信息。住院测序分型的36例患儿有基础疾病占34.37%（11/32），其中患有先天性心脏病占21.87%（7/32）。A基因型6例，患先天性心脏病4例（同时患有轻度贫血、室性早搏1例；先天喉喘鸣1例；三体综合征、先天性脑发育异常1例）、先天性喉骨软化症1例、肾缺如1例；B基因型5例患儿，患有先天性心脏病3例、左侧胸壁血管瘤1例，不完全川崎病1例。

3 讨论

在前期的研究中，课题组曾报道杭州地区呼吸道感染患儿hMPV的检测及流行情况，本研究主要对门诊ILI和住院SARI中hMPV感染进行比较。为期3年的监测，杭州门诊流感样病例中6.62%感染患儿与hMPV有关，住院严重急性呼吸道感染病例中6.32%感染患儿与hMPV有关，这一结果高于朱汝南等［4］2004-2006年在北京开展的研究报道，1289份门诊患儿的咽拭子 29份 hMPV阳性（2.25%）、2041份住院患儿的鼻咽洗液81份hMPV阳性（3.96%）的结果；杭州住院严重急性呼吸道感染病例患儿hMPV检测结果低于苏州地区［10］住院儿童hMPV的检出率为8.9%结果。可能由于病例选择标准不同，地理位置存在南、北方地区差异有关。在以往对hMPV的研究中，国内外都注重对住院儿童的下呼吸道感染的研究，而对门诊病例及上呼吸道hMPV感染研究甚少。本研究发现门诊ILI中有相当比例的hMPV感染患儿，不容忽视。

本次研究hMPV阳性患儿门诊ILI平均年龄（31.33±18.50月）大于住院SARI为（10.41±8.28月）。＜1岁组住院患儿检出率6.33%（43/679）高于门诊2.79%（19/681），检出率差异有统计学意义。在hMPV感染的门诊ILI患儿中1～3岁最多，占64.86%，住院 SARI患儿中 ＜1岁最多，占74.13%。提示门诊ILI1～3岁组和住院SARI＜1岁组hMPV感染威胁更大。杭州hMPV感染大多在冬季和初春，研究表明杭州地区：不同来源病例样本选择季节检出率明显不同，冬季呼吸道门诊ILI的hMPV检出率（13.56%）高于同期住院 SARI （8.06%）患儿，差异有统计学意义，hMPV感染住院病例流行高峰滞后门诊，可能与门诊为流感样病例就诊早，住院患儿来源与分诊病例。

hMPV与流感病毒、呼吸道合胞病毒共感染率住院SARI病例（32.75%）高于门诊ILI（18.01%），检出率差异有统计学意义。门诊病例hMPV主要与INF混合感染（60.00%），可能与流感病毒高居门诊呼吸道病毒流行首位有关；住院病例hMPV阳性与RSV有高比例共同感染（63.15%），与 Konig B［11］等学者发现有60%hMPV感染的儿童合并RSV感染，结果是相一致。

监测期间杭州地区呼吸道门诊流感样病例和住院严重急性呼吸道感染病例hMPV株各存在3个基因亚型（A2、B1和B2；A1、A2和B1）流行。在前期研究中2009.11-2011.1杭州仅为B1基因亚型［12］，2011年以B1亚型为优势 （10/12），2012年以A2亚型为优势流行型（8/12）［13］。门诊52株测序分析A2占50.00%、B1占34.61%、B2占15.38；住院测序的36株分型A2占55.55%、B1占41.66%、A1 占2.77%。门诊hMPV阳性未检测到A1亚型，住院未检测到B2亚型。有研究认为，A型hMPV的致病性高于B型［14］，另一份报道则认为两种型别的致病性没有差别［15］。我们对杭州地区儿童的hMPV阳性的ILI、SARI基因分型统计未发现有差异。由于缺乏临床、影象学等资料，不能全面反映临床与基因型的特征，这些都有待于今后的研究。

本研究仍存在一些局限性，如儿科呼吸道门诊仅收集流感样病例，观察病例缺乏临床资料和预后的信息。hMPV作为新发现的人类急性呼吸道感染的病毒病原，越来越受到人们的重视，在今后的研究中我们将逐步完善研究内容，扩大样品的检测范围、数量和检测时间，进行数据积累和分析，进一步评估hMPV相关疾病的危害，对该病毒的预防和控制感染提供更多的科学依据。

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Molecular detection and typing of human Metapnenmovirus in children with respiratory tract infection

Kou Yu，Yu Xinfen，Li Jun，Yang Xuhui，Zou Yinyan，PanJincao，Xie Li，Sun Zhou，Pu Xiaoying，Cen Shuchang
Microbiology Laboratory，Hangzhou Center for Disease Contorl and Prevention，Hangzhou 310021，China

Kou Yu，Email：kouyu09@126.com

ObjectiveTo understand the infection status and mo1ecu1ar features of human metapnenmovirus（hMPV）among pediatric outpatients and inpatients.Methods A11 2 593 chi1dren with respiratory tract infections who visited the sentine1 survei11ance hospita1s from 2011 to 2013 in Hangzhou，，inc1uding 1 050 outpatients and 1 016 inpatients，were invo1ved in this study.The throat swabs were co11ected from inf1uenza-1ike i11ness（ILI）in the c1inic，and trachea1 aspirates from hospita1ized chi1dren with severe acute respiratory infection（SARI）.The specimens were tested using quantitative rea1-time reverse transcription po1ymerase chain reaction（RT-PCR）.The fusion（F）protein gene of hMPV was amp1ified for sequencing and phy1ogenetic ana1ysis.Results The positive rate was 6.62%（111/1 676）in outpatients and 6.32%（58/917）in inpatients，which showed no statistica11y significant difference by comparing the rates（χ2=0.086，P=0.769）.The positive rate in inpatient（6.33%，43/679）was higher than that in outpatient（2.79%，19/681）in chi1dren＜1 year of age（χ2=9.808，P=0.002）.The average age of hMPV-positive outpatients（31.33±18.50 months）was e1der than inpatients（（31.33±18.50 months）.The positive rate in outpatients（13.56%，59/435）was higher than that in inpatient（8.06%，20/248）in winter（χ2=4.669，P=0.031）.The co-infection rate in inpatients（31.04%，19/58）was higher than that in outpatients（18.01%，20/111）（χ2=4.663，P=0.031）.Data showed that 3 vira1 subtypes appeared in outpatient specimens，and the genotype A2 occurred most frequent1y.The c1inica1features showed no difference in a11 subtypes.ConclusionsThe rates of hMPV infection showed no significant difference between outpatients and inpatients.The average age of outpatients was o1der than the age of inpatients who infected the hMPV.The positive rate in outpatients was higher than that in inpatient in winter.The main pathogens co-infected with hMPV were different in outpatients and inpatients.The genotype A2 was predominant in the study.

Human Metapneumovirus；Chi1dren；Inf1uenza-1ike i11ness；Severe acute respiratory infection；Mo1ecu1ar typing

杭州市科技局资助项目（20110833B36，20120533Q24）

寇宇，Emai1：kouyu09@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.013

2015-01-04）