2007-2014年柯萨奇病毒B5四川分离株的基因特征分析

马小珍 童文彬 刘李 曹冉冉 陈娜

610041成都，四川省疾病预防控制中心

2007-2014年柯萨奇病毒B5四川分离株的基因特征分析

马小珍 童文彬 刘李 曹冉冉 陈娜

610041成都，四川省疾病预防控制中心

目的 了解2007-2014年四川省急性弛缓性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例中柯萨奇病毒B组5型（Coxsackie virus B5，CVB5）的基因特征。方法 对四川省2007～2014年AFP病例中分离到的10株CVB5进行全VP1区逆转录-聚合酶链（RT-PCR）反应扩增和核苷酸序列测定，构建遗传进化树进行基因特征分析。结果 10株分离株均为D基因型，与CVB5原型株（Fau1kner株）之间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为80.4%～81.9%和95%～97.1%。2014年1株资阳分离株和1株成都分离株VP1区氨基酸序列完全一致，1株南充分离株和1株宜宾分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性均为100%。结论 2007-2014年四川地区AFP病例中分离到的CVB5为D基因型，且遗传特性较为稳定。

【主题词】 急性驰缓性麻痹；柯萨奇病毒B组5型；基因特征分析

肠道病毒（EV）隶属小核糖核酸病毒科肠道病毒属，为单股正链的无包膜RNA病毒，包括脊髓灰质炎病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒及新型肠道病毒，根据生物学及遗传特性分为（A、B、C、D）4个组［1］。EV感染可引起麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌疾病、手足口病、急性出血性结膜炎、肝炎、出疹性疾病、婴儿腹泻和胰岛素依赖型糖尿病等多种疾病，还可引起一些诸如发热等类似感冒的综合病症［2，3］。多数HEV都可引起肢体麻痹，特别是脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒，其中脊髓灰质炎病毒感染后可造成肌张力减弱、肌力下降、腱反射减弱或消失，留下严重后遗症；柯萨奇病毒和埃可病毒与脊髓灰质炎病毒临床症状相似，但较脊灰发病轻，一般没有残留麻痹。

柯萨奇 B组病毒（Coxsackieviruses group B，CVB）分为CVB1～CVB6六个血清型，均能在人群中引起小范围的流行，进一步研究还发现CVB和一些慢性疾病的发生密切相关。柯萨奇病毒B5（CVB5）感染可引起多种人类疾病，包括无菌性脑膜炎、肌肉麻痹、病毒性心肌炎、手足口病、胰腺炎和糖尿病等，在我国均有报道［4］。

急性弛缓性麻痹（acute f1accid para1ysis，AFP）病例监测系统是以消灭脊髓灰质炎为目的而建立的一个监测系统，而AFP病例的诊断要点为急性起病、肌张力减弱、肌力下降、腱反射减弱或消失。而其他HEV感染也可引起这些症状的出现，因此每年都可从AFP病例的粪便标本中分离到大量的非脊灰肠道病毒，即可以利用AFP病例监测系统作为一种便捷有效的肠道病毒监测手段。

因病毒主要的免疫原性蛋白和中和抗原决定簇位点在VP1上，对VP1区的研究能够用于肠道病毒分子分型和进化分析［5，6］。本研究通过对四川省2007-2014年AFP病例中分离到的CVB5进行VP1区基因序列分析和分子流行学特征分析，回顾性研究CVB5不同基因亚型的时间分布和地区分布，进一步了解病毒的传播动态。

1 材料与方法

1.1标本来源 所用标本来源于2007-2014年四川省AFP病例粪便标本，由县区级疾病预防控制中心采集，冷藏运送至省级疾病预防控制中心实验室，-20℃冷藏保存。

1.2病毒分离 所有粪便标本均按照WHO《脊髓灰质炎实验室手册》第四版方法用RD（人横纹肌肉瘤细胞）、L20B（转人脊灰病毒受体的小鼠肺细胞）细胞进行细胞培养、病毒分离，病毒阳性分离物-80℃冷藏保存［7］。实验前接种RD细胞进行病毒增殖。

1.3病毒鉴定 采用微量中和试验法确定病毒型别（肠道病毒组合血清由中国疾病预防控制中心病毒病所脊灰实验室提供）。

1.4RNA提取 采用Promega Maxwe11 16核酸自动提取仪进行病毒RNA提取。按照说明书从200 μ1的细胞培养物中提取50 μ1的病毒RNA，-80℃冷藏保存。

1.5VP1区RT-PCR及序列测定 RT-PCR反应采用Invitrogen公司的Super Script III One-step RTPCR System试剂盒，使用引物490/492和491/493分段进行全VP1区的核苷酸序列扩增［6］。反应条件为：反转录45℃25 min，预变性94℃2 min，变性94℃15 s，退火48℃30 s，延伸65℃1.5 min，共40个循环，最后65℃5 min延伸。目的基因片段大小分别为700 bp和750 bp，在毛细管电泳上鉴定后用Wizard SV Ge1 and PCR C1eanup System（Promega）按厂家说明书进行纯化。纯化PCR产物用相同引物分别进行双向标记，标记试剂为Bigdye Terminator v3.1 Cyc1e Sequencing Kit（App1ied Biosystems），反应条件为：变性96℃ 10 s，退火50℃ 5 s，延伸60 ℃ 4 min，共 25个循环。标记产物用 BigDye XTerminator Purification Kit（App1ied Biosystems）再次纯化后，在 3500 XL Genetic Ana1yzer（App1ied Biosystems）上完成测序。

1.6序列分析 序列用Sequencher 5.0和Bioedit 7.0.9.0软件编辑处理，使用NCBI中BLAST程序初步确定血清型，对所有毒株的全VP1序列进行同源性分析，采用 Mega6.0软件进行遗传进化分析（Kimura 2参数模型，邻位 -连接法，1000次bootstrap检验）。

2 结果

2.1病毒分离与鉴定 2007-2014年共采集的AFP病例粪便标本2889份，分离到病毒阳性分离物313株，分离率为10.8%。所有毒株均已用肠道病毒组合血清和VP1区基因序列完成分型鉴定。其中肠道病毒A组8个型别，CVA4、CVA10、EV-A71这三个型别共占所有肠道病毒A组的78.38%；肠道病毒B组最多共24个型别，E14、E11、E6、CVB3、CVB5、E13较多；肠道病毒C组仅有2个型别，为CVA21和CVA24。在313株中，10株病毒阳性分离物被鉴定为CVB5，其中2007年分离到1株，分离率为0.03%（1/330）；2010年分离到1株，分离率为0.03%（1/338）；2014年分离到 8株，分离率为0.20%（8/396）；其余年份未分离到CVB5。所有序列均已上传至 GenBank，登录号为 LC120343～LC120352。CVB5相关病例的地区分布、麻痹时间、诊断结果见表1。

2.2同源性分析 本次分离到的10株CVB5的VP1区全长849 bp，编码283个氨基酸，与原型株（Fau1kner）相比，无碱基的插入和缺失，在氨基酸序列上共有17个位点发生变异，其中有8个位点是10株同时变异，另外9个位点有部分分离株发生变异。与原型株之间的核苷酸同源性为80.4% ～81.9%，氨基酸同源性为95% ～97.1%。这10株CVB5分离株之间的核苷酸同源性为 89.8% ～100%，氨基酸同源性为97.1% ～100%，其中14-1 和14-320VP1区核苷酸同源性和氨基酸同源性均为100%，而14-235和14-324的VP1区氨基酸序列完全一致。

表1　四川省CVB5分离株相关AFP病例的地区分布、麻痹时间和诊断结果Tab.1 Endemic distribution，time of para1ysis and c1inica1 diagnosis of CV5 re1ated AFP cases

2.3进化树分析 以CVB3原型株（Nancy株）和埃可病毒15型（Echovirus 15，E15）CH96—51株为外对照，将分离到的10株病毒与GenBank中检索到的19条CVB5的VP1区核苷酸序列构建亲缘进化树，以此明确四川省CVB5分离株的遗传进化规律以及同国内外CVB5分离株的亲缘关系，见图1。进化树分析表明，CVB5划分为A、B、C、D 4个基因型。A基因型只包括原型株Fau1kner/AF114383株；B基因型主要为在欧美多个国家流行的毒株；C基因型包括我国山东省和韩国的两株分离株Shandong/ CHN/GQ329771和KOR/AY875692，与他们同源性最近的还有3株猪水疱病毒（swine vesicu1ar disease viruses，SVDV）。10株四川省CVB5分离株均属于D基因型。

3 讨论

在CVB中，CVB5是引起人类疾病的最常见血清型。CVB5已在世界范围内广泛流行，且有较高的感染率，近年我国山东省、河南省、浙江省、云南省等均报道过由CVB5引起的无菌性脑膜炎暴发和散发［8-10］，福建省、安徽省也报道过从手足口病例中分离到CVB5［11，12］。本次研究的10例由CVB5感染引起的相关AFP病例中，5例诊断为格林巴列综合征，4例诊断为肌炎，还有1例诊断为非脊灰肠道病毒感染。回顾性研究限制了我们得到更多的临床相关信息，但仍然可以帮助我们确定CVB5能够引起麻痹性疾病。

▲为CVB5四川分离株图1　CVB5全VP1区序列进化树▲represents Sichuan iso1atesFig.1 Phy1ogenetic ana1ysis of VP1 region of CVB5

从2007-2014年四川省AFP病例标本分离到的10株CVB5中，2014年一共分离到8株，占CVB5分离株的80%。鉴于AFP监测没有涵盖CVB5可引起的所有病征，且由于肠道病毒为隐性感染，只有0.1%～1%的感染者会出现临床症状，说明2014年四川省CVB5的感染者大约在800～8000例，提示2014年四川省肠道病毒的优势基因型可能变为CVB5，并在四川省呈现流行状态。而在2014年的8株分离株中，1株资阳分离株和1株成都分离株VP1区氨基酸序列完全一致，成都市与资阳市相邻；1株南充分离株和1株宜宾分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性均为100%，而南充市和宜宾市行政区域未接壤，说明CVB5不仅可以在相邻区域传播，还可以跨区域传播。

本研究中的10株CVB5分离株在VP1区氨基酸序列上与原型株相比，在第7、75、90、91、125、132、268和273氨基酸位点均发生了变异，同法国、韩国以及我国浙江、山东、云南等地的分离株一致。而在第3位和第80位上，有4株的氨基酸从P和K变为T和R；在第19位和第54位，有1株由G和K分别变为E和R；在第95位，7株分离株的氨基酸从N变异为S；第200位有5株从R变为K；在244位，有1株由V变为I；在第259和第278位，有1株由K和T变异为M和I。关于病毒序列变异与病毒毒力和临床致病性的关系是近年临床和分子生物工作者努力研究的课题，但本研究中CVB5的VP1氨基酸变异与临床表现的确切关系不明，可能与以下因素有关：首先VP1蛋白是EV的主要结构蛋白，关键部位氨基酸的变化可能会引起病毒空间结构的变化，从而导致病毒毒力变化；其次VP1序列变异对感染机体的某些免疫活性细胞和活性分子的调控基因和结构基因的表达可能会产生影响；最后本研究是从AFP病例中得到的分离株，由于CVB5能够引起的疾病种类较多，这些氨基酸位点的变化会否引起其他疾病临床表现不同还需要进一步研究。

VP1区核苷酸序列亲缘进化树显示CVB5在地理和时间分布上有一定的聚集性，A基因型仅有1950年分离的原型株Fau1kner株；B基因型主要为1985-2002年在欧美多个国家流行的毒株；C基因型于20世纪70年代中期至20世纪末在亚洲流行，与他们同源性最近的SVDV在抗原性上与CVB5相似，一般只在猪中间流行，不引起人类发病；D基因型是目前在世界范围内流行的基因型，包括芬兰、法国、韩国等均分离到 D基因型［13，14］，我国山东、浙江、云南、河南等地的分离株也为D基因型。本次分离到的10株CVB5四川分离株均属于D基因型，与我国及世界流行情况相符。且这10株分离株亲缘关系都较近，说明四川省CVB5遗传特性较为稳定。而07年泸州分离株和10年泸州分离株亲缘关系很近，说明CVB5在泸州地区从2007年到2010年可能发生持续流行且遗传特性稳定。

本研究利用AFP病例监测系统对CVB5进行

监测，了解其基因特征和流行情况，有助于CVB5相关疾病的预防和控制。

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Genetic characteristics of Coxsackie virus B5 isolates in Sichuan province over 2007-2014

MaXiaozhen，Tong Wenbin，Liu Li，Cao Ranran，Chen Na Sichuan Center for Disease Control and Prevention，Chengdu 610041，China

Chen Na，Email：emmanana@163.com

Objective To investigate genetic characteristics of Coxsackie virus B5（CVB5）in acute f1accid para1ysis（AFP）cases in Sichuan Province.Methods 10 CVB5 strains iso1ated from stoo1 samp1es of AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were subjected to entire VP1 coding region amp1ification by reverse transcription-po1ymerase chain reaction（RT-PCR）and nuc1eotide sequencing，and phy1ogenetic tree was constructed for genetic characterization.Results A11 of the 10 strains were identified as genogroup D.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies were 80.4%-81.9%and 95%-97.1%，which compared with the Fau1kner prototype strain.The amino acid homo1ogies between Ziyang strain and Chengdu strain obtained in 2014 were 100%，respective1y.The nuc1eotide and the amino acid homo1ogies between Nanchong iso1ate and Yibin iso1ate obtained in 2014 were both 100%，respective1y.Conclusions The iso1ates from AFP cases in Sichuan Province over 2007-2014 were be1ong to genogroup D.The genetic characteristics of 10 strains were stab1e.

Acute f1accid para1ysis；Coxsackie virus B5；Genetic characteristics ana1ysis

陈娜，Emai1：emmanana@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.012

2015-12-23）