2012-2015年上海地区成人甲型H3N2流感病毒抗原漂变分析

夏益兰 张万菊 田棣 代发辉 宋志刚 冯净净 揭志军 杨天芸 郭雪君 俞慧菊 任涛 袁正宏 胡芸文

201508上海，复旦大学附属公共卫生临床中心（夏益兰）；201508上海市公共卫生临床中心（张万菊、田棣、代发辉、宋志刚、胡芸文）；200240上海市第五人民医院（冯净净、揭志军）；200092上海交通大学医学院附属新华医院（杨天芸、郭雪君、俞慧菊）；200120上海，同济大学附属东方医院（任涛）；200032上海，复旦大学上海医学院（袁正宏）

2012-2015年上海地区成人甲型H3N2流感病毒抗原漂变分析

夏益兰 张万菊 田棣 代发辉 宋志刚 冯净净 揭志军 杨天芸 郭雪君 俞慧菊 任涛 袁正宏 胡芸文

201508上海，复旦大学附属公共卫生临床中心（夏益兰）；201508上海市公共卫生临床中心（张万菊、田棣、代发辉、宋志刚、胡芸文）；200240上海市第五人民医院（冯净净、揭志军）；200092上海交通大学医学院附属新华医院（杨天芸、郭雪君、俞慧菊）；200120上海，同济大学附属东方医院（任涛）；200032上海，复旦大学上海医学院（袁正宏）

目的 通过分析2012-2015上海地区成年人甲型H3N2流感病毒的分子流行病学及HA抗原漂变情况，从而了解甲型H3N2流感病毒分子流行及变异变迁规律。方法 采集2012-2015年间上海地区三家哨点医院流感样成人病例的呼吸道标本，收集临床资料。提取标本核酸后用实时荧光PCR检测流感病毒，对甲型流感病毒阳性的标本进一步进行基因分型。对H3N2阳性标本扩增血凝素（HA）基因片段、测序和进行基因变异分析。结果 总共收集2 346例病例，甲型流感病毒核酸检测阳性病例331例，其中273例为H3N2流感病毒阳性，58例为2009 pdmH1N1流感病毒阳性。2012年-2015年期间，上海地区H3N2流感病毒在每年的冬春季流行，但在2014年和2015年均呈现夏季流行高峰。对2012年-2015年间获得的上海地区180个H3N2流感病毒的HA基因全长序列进行系统进化树分析发现：2012-2015年间H3N2流感病毒总共引起了3个主要的流感流行峰，分别是2013年12月-2014年1月、2014年7-8月和2015年7-8月，且分别属于三个不同的基因簇：A/ Fin1and/385/2013类似株，为group 3C.3b；A/Switzer1and/9715293/2013类似株（SW13），为group 3C. 3a和A/Hong Kong/5783/2014类似株（HK14），group 3C.2a分支。比较3个流行峰的甲型H3N2流感病毒，发现血凝素蛋白氨基酸序列存在一定差异，主要分布于抗原表位和受体结合位点（RBS）。结论2012-2015年间，上海地区流行的H3N2流感病毒出现明显的2次抗原漂变，可能是导致上海地区近年来H3N2流感流行的原因。

【主题词】 H3N2流感病毒；抗原漂变

Fund programs：Nationa1 Science and Techno1ogy Major Project（2012ZX10004-211）；The Major State Basic Research Deve1opment Program of China（2014AA021403）；The Yangtze River De1ta Techno1ogy Joint Research Project（14495810302）

流感病毒被认为是人类呼吸道感染最常见的病原体，引起频繁的季节性流行和偶尔的世界大流行［1］。由于其高发病率和高死亡率而成为全球普遍关注的问题。

甲型H3N2流感病毒自1968年出现以来，在人群中流行一直较为活跃，每3-8年就会出现新抗原漂变株［2］。其中引起流感病毒抗原漂变的主要是HA抗原，H3N2亚型流感病毒HA蛋白球头部表面有5个主要的抗原决定簇（A、B、C、D、E）。因流感病毒是分节段负链RNA病毒，其RNA聚合酶缺乏5'-3'端校准功能［3］，使得HA基因不断发生突变从而引起抗原漂移（antigenic drift），从而引发小流行；由于其基因分节段，易于发生基因重配而引起抗原转换（antigenic shift），从而引起世界性大流行。因此，监测流感病毒抗原表位的变异，研究抗原性的漂变，对于评估流感疫苗株的适用性以及预测流感流行具有重要意义［4］。

1 对象与方法

1.1研究对象 本研究收集2012年9月至2015 年8月从同济大学附属东方医院、上海交通大学附属新华医院和复旦大学附属第五人民医院流感样病例患者的临床资料和呼吸道标本，包括咽拭子、痰、鼻咽抽吸物和肺泡灌洗液。

1.2核酸提取 利用高通量核酸自动抽提仪（QIAcube HT P1asticware）和核酸抽提试剂盒（cador Pathogen 96 QIAcube HT Kit），按照说明书对呼吸道新鲜标本进行病毒核酸抽提。新鲜抽提的核酸在24 h之内检测或存于-80℃冰箱待用。

1.3流感病毒检测及分型 根据WHO全球流感监测中心提供的引物序列和方法（http：//www. who.int/inf1uenza/gisrs_1aboratory/manua1_diagnosis survei11ance inf1uenza/en/），在ABI VII7荧光PCR仪上进行一步法Rea1-time RT-PCR反应，对核酸进行甲型和乙型流感病毒检测及甲型H3N2和2009 pdmH1N1流感病毒分型检测。25 μ1混合反应体系（TaKaRa公司）包括2×Buffer 12.5 μ1、反转录酶2.5 U、HS Taq 2.5 U、引物10 pmo1、探针5 pmo1和2.5 μ1 RNA模板。反应参数：42℃反转录10 min；94℃预变性2 min；94℃变性10 s，55℃50 s（采集荧光），40个循环。

1.4H3N2流感病毒HA基因序列扩增 HA1基因片段（nt：1-946）引物序列为 H3N2-HA1-F：5'-ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCT-3'；H3N2-HA1-R：5'-GATCTTGTTTACATTTTGGAA-3'；HA2基因片段（nt：848-1701）引物序列为H3N2-HA2-F：5'-ATGAGATCAGATGCACCCA-3'；H3N2-HA2-R：5'-AAATGTTGCACCTAATGTTCGTAAACT-3'。采用大连宝生物公司TaKaRa一步法RT-PCR试剂。

1.5序列测定及分析 测序试剂盒 ABI Prism BigDye Terminator cyc1e sequencing kit3.1，测序仪器为DNA分析仪ABI 3730XL。H3N2流感病毒HA基因参考序列来源于GISAID和GenBank数据库。利用BioEdit7.1.3.0版本软件包里的C1usta1W程序进行序列编辑、翻译和比对。用最大似然法（MEGA 6.06软件）对核苷酸序列进行系统进化树分析。

1.6N端糖基化位点预测 用NetNG1yc 1.0软件在线预测HA蛋白的N-糖基化位点，符合Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaa不能是脯氨酸）基序特征的天冬酰胺位点（可能性阈值＞0.5）被认为是潜在的糖基化位点。

2 结果

2.1流感病毒分子分型和流行特征分析 2012年9月至2015年8月间总共收集来自2 346个病例的2 939份呼吸道标本。其中甲型流感病毒（F1u A）和乙型流感病毒（F1u B）检测阳性数分别为 331 （11.26%）和75（2.55%），F1uA阳性标本中273份（82.48%）为 H3N2亚型流感病毒和 58份（17.52%）为2009pdmH1N1亚型流感病毒。

H3N2亚型流感病毒、2009pdmH1N1和F1uB在时间上呈现交替流行趋势（见图1）。在研究周期内观察到5个较明显的流行峰，其中3个是由H3N2亚型流感病毒引起的，流行时间分别是2013年12 月-2014年1月、2014年7-8月和2015年7-8月，流感病毒的月检出率分别是21.86%～30%、30.36% ～32.97%和28.99%～43.57%。另外两个流行峰分别出现在2013年12月-2014年1月和2015年1-2月，前者是由2009pdmH1N1流行所致（月检出率15.00-29.17%），后者是由F1u B流行所致（月检出率22.58-35.64%）。

图1　2012-2015年上海地区成年人流感病毒检出率分月图Fig.1 Month1y distribution of samp1es testing positive for inf1uenza virus among adu1ts with inf1uenza-1ike i11ness in Shanghai from September 2012 to August 2015

2.2HA基因进化分析 共获得2012年9月-2015 年8月间180个H3N2亚型流感病毒阳性标本（占检出阳性标本的65.93%）的 HA基因全长序列。利用MEGA 6.06软件，采用最大似然法对H3N2流感病毒HA基因序列构建进化树（见图2A），可见上海地区的流行株主要分布在Group 3C.3和3C.2两大分支。进一步分析不同流行期中H3N2流感病毒HA基因变异情况（图2B）：2012年10月-2014年6月期间的流行株分属于3个进化分支：其中72.1% （n=49）属于Group3C.3，为A/Fin1and/385/2013类似株；26.4%（n=18）属于Group3C.2；1.5%（n= 1）为 Group3B；均与同期疫苗株 A/Victoria/361/ 2011（VIC11）（group 3C.1）在不同分支上；2014年7-9月期间，H3N2亚型呈夏季流行，流行株转换为Group 3C.3a（SW13类似株），与同期北半球疫苗株

‘●'指2013-2014北半球疫苗株；‘■'指2014-2015北半球疫苗株；‘▲'指基因亚型3C.2a代表株；A上海地区2012-2015年甲型H3N2流感病毒血凝素HA基因系统进化树B上海地区2012-2015年不同流行时段甲型H3N2流感病毒HA变异株比例图2　2012-2015年上海地区甲型H3N2流感病毒HA基因进化分析B1ack circ1e and b1ack square indicates the WHO recommended composition of inf1uenza virus vaccines for the 2013-14 and 2014-15 northern hemisphere inf1uenza seasons respective1y.The representative group 3C.2a strain（A/Hong Kong/5738/2014）is 1abe1ed with b1ack triang1es.A.Phy1ogenetic tree of hemagg1utinin gene of the inf1uenza A（H3N2）viruses in Shanghai，2012-2015.B.HA genetic variantsof Inf1uenza A（H3N2）viruses proportion in Shanghai，during2012-2015.Fig.2 Phy1ogenetic ana1ysis of hemagg1utinin gene of the inf1uenza A（H3N2）viruses in Shanghai，2012-2015

A/Tesax/50/2012（TX12）（Group 3C.1）不同；而在2014年10月-2015年6月间，流行毒株中71.5%（n =10）属于Group 3C.2a（HK14类似株），28.5%（n =4）属于Group 3C.3a分支（SW13类似株），呈共流行趋势；2015年7-8月夏季流行期的43株流感病毒均属于Group 3C.2a（HK14类似株），与同期北半球疫苗株（SW13）隶属于不同的进化分支。

2.3HA蛋白抗原表位变异分析 比较3个流行峰优势毒株的HA氨基酸序列位点变异（见图3），结果显示2014年7-8月流行期H3N2流感病毒与2013年12月-2014年1月的流行株相比，HA抗原决定簇有 5个氨基酸突变（A：T144A，A154S，R158G；B：F175S；E：H110Y），RBS有3个氨基酸位点突变（A154S，F175S，N241D）。2015年7-8月流行期H3N2流感病毒与2014年7-8月相比，HA抗原决定簇有 6个氨基酸位点突变（A：A144T，S154A，G158R，N160S；B：S175Y，K176T），RBS有3个氨基酸位点突变（S154A，N160S，S175Y）。同时，分别比较3个流行峰的优势毒株与同期疫苗毒株在HA氨基酸序列上的差异，发现流行毒株在HA抗原决定簇（A-E）和RBS均有氨基酸的突变。2013年12月-2014年1月流行期的H3N2流感病毒与同期疫苗株相比，HA抗原决定簇有7个氨基酸突变（A：T144A（26/40），R158G（27/40），N161S；B：R172H，V202G；C：N294K；E：Y110H（13/40）），RBS有3个氨基酸突变（N161S、R172H和V202G）。2014年7-8月流行期的H3N2流感病毒与同期疫苗株相比，HA抗原决定簇有8个氨基酸突变（A：N144A，A154S，R158G，N161S；B：F175S，V202G，P214S；D：F235S），RBS有6个氨基酸突变（A154S，N161S，F175S，V202G，F235S和N241D）。2015年7-8月流行期的H3N2流感病毒与同期疫苗株相比，HA抗原决定簇有 6个氨基酸突变（A：A144T、S154A、G158R、N160S；B：S175Y、K176T），RBS有3个氨基酸位点突变（S154A、N160S和S175Y）。

2.4HA蛋白糖基化位点预测分析 对2012-2015年间获得的180个H3N2流感病毒株的HA蛋白利用NetNG1yc 1.0软件进行糖基化位点预测。2014 年7-8月流行期的H3N2流感病毒与2013年12月-2014年1月相比失去了2个糖基化位点（142位和160位）。2015年7-8月流行期的H3N2流感病毒和2014年7-8月相比新增2个糖基化位点（142位和174位）。同时，2013年12月-2014年1月流行期的H3N2流感病毒与同期疫苗株VIC11相比在第54位新增加了一个糖基化位点，而在第142位失去了一个糖基化位点。而2014年7-8月流行期的H3N2流感病毒HA蛋白的糖基化位点与同期北半球疫苗株相同TX12。2015年7-8月流行期的H3N2流感病毒与同期疫苗株SW13相比，新增了2个糖基化位点（分别为149位和174位）。

A、B、C、D、E、R分别表示抗原决定簇A、B、C、D、E和受体结合位点RBS图3　2012-2015年上海地区H3N2流感病毒相对于同期疫苗株的HA氨基酸序列突变位点分析The 1etter A、B、C、D、E、R refer to epitope A，epitope B，epitope C，epitope D，epitope E and receptor binding siteFig.3 Amino acid substitutions observed in antigenic epitopes，receptor binding sites（RBS）and other mutations of the HAprotein of H3N2 Viruses iso1ated among three outbreaks from Sept.2012 to Aug.2015 in Shanghai，China，comparedto the vaccine strains of the corresponding inf1uenza season respective1y

3 讨论

本研究分析了上海地区2012-2015年间的甲型H3N2流感流行情况。除在2013年12月-2014年1月冬季流行外，2014年和2015年均出现了夏季流行。季节性流感一般在温带呈冬季流行，而在热带则呈不规则的流行［5］。虽然上海地处北半球温带，但在2014年和2015年的夏季均出现了甲型H3N2流感病毒的流行，除了气候因素外，提示流行毒株的抗原性可能发生了较大的改变，而导致人群普遍易感。

深入分析上述2个夏季流行峰，发现它们分别因H3N2亚型流感病毒SW13类似株和HK14类似株的高位流行而发生。在这2个流行峰的间隔期（2014-2015冬季），SW13类似株和HK14类似株共同存在于上海地区的人群中，并以前者为主。杭州疾控中心也发现，杭州地区在2014年出现SW13类似株的夏季流行［6］，而2014-2015年冬春季则是SW13类似株和HK14类似株共同流行。根据国家流感中心和中科院课题组对全球范围内H3N2病毒变异的研究，发现SW13类似株早在2012年就已出现，并于2013年和2014年期间在美国、欧洲和中国大陆均呈一定规模的流行［7］，而在2014-2015冬春季则进一步呈现SW13类似株与HK14类似株共流行的趋势［8，9］。根据上述研究结果可推测，SW13类似株和HK14类似株可能在近几年引起了全球性的流行，而上海作为人口流动频繁的国际性大都市，其流感的流行可能同时受国际和国内两方面的影响，因而与国内外的流行模式相似。

通常认为，如果抗原决定簇中的4个以上位点发生突变，且这些位点分布在不同的抗原决定簇上时，表明新的抗原漂变株出现［10］。本研究中关注的3个H3N2流行高峰期毒株之间的比较发现，HA发生了5-6个氨基酸位点突变，且主要分布在A、B抗原决定簇上，提示新现流行株已发生了明显的抗原漂变，这可能是导致上海地区2012-2015年期间2 次H3N2亚型流感夏季流行的主要原因。

有研究表明，流感病毒HA突变位点如同时属于抗原决定簇和RBS及其附近位点，则被认为是抗原漂变的决定位点［10］。通过对这3个流行峰毒株的突变位点变化分析发现，从2013-2015年间，第175（F-S-Y）位既是抗原决定簇也是RBS，因此可能是导致这两次夏季流行的主要突变位点。而第144 （T-A-T）、154（A-S-A）、158（R-G-R）位虽既是抗原决定簇又是RBS或其附近位点，但是发生了回复性突变，因此可能是导致2014年夏季流行的突变位点，且第 160（N-N-S）、176（K-K-T）位仅在 2014-2015年间发生了突变，因此这两个位点可能是导致2015年夏季流行的突变位点。但是，哪些关键氨基酸位点的突变会主导抗原漂变？仍需要进一步通过实验进行验证。

当HA蛋白的球头部发生糖基化时，可以通过空间位阻或掩盖抗原表位，阻止中和性抗体和HA抗原表位的结合，从而使病毒逃避宿主免疫［11，12］。本研究对上海地区2012-2015年的甲型H3N2流感病毒HA进行潜在糖基化位点预测分析，发现不同流行期的甲型H3N2流感病毒HA氨基酸序列在抗原决定簇A、B或其附近有糖基化位点缺失和（或）增加，这可能在一定程度上帮助病毒逃逸机体中和抗体的识别进而增强病毒在人群中的传播力。

总之，我们对上海地区2012-2015年间流感病毒的流行情况以及甲型H3N2流感病毒HA抗原漂变进行了监测和分析，为上海地区流感的防控工作提供基础数据。

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Antigenic analysis of the human Influenza A（H3N2）virus during 2012-2015 in Shanghai，China

Xia Yilan，Zhang Wanju，Tian Di，Dai Fahui，Song Zhigang，Feng Jingjing，Jie Zhijun，Yang Tianyun，Guo Xuejun，Yu Huiju，Ren Tao，Yuan Zhenghong，Hu Yunwen Pathogen Diagnosis and Biosafety Department，Shanghai Public Health Clinical Center，Fudan University，Shanghai 201508，China（Xia YL）；Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China （Zhang WJ，Tian D，Dai FH，Song ZG，Hu YW）；Shanghai Medical College，Fudan University 200032，China（Yuan ZH）；East Hospital Affilited，Tongji University，Shanghai 200120，China（Ren T）；Xinhua Hospital Affilited，Jiao Tong University of Shanghai 200092，China（Yang TY，Yu HJ，Guo XJ）；Rrespiration Departmen，Fifth People's Hospital，Fudan University，Shanghai 200240，China（Feng JJ，Jie ZJ）

Hu Yunwen，Email：ywhu0117@126.com；Yuan Zhenghong，Email：zhyuan@shaph. org

ObjectiveTo understand the patterns of emergence and circu1ation of inf1uenza A （H3N2）virus variants in Shanghai area，we investigated the genetic evo1ution of the hemagg1utinin（HA）gene and epidemic characteristics of the inf1uenza A（H3N2）viruses which were circu1ated in Shanghai，China，from September 2012 to August 2015.Methods Respiratory c1inica1 samp1es were co11ected by c1inicians from patients with inf1uenza-1ike i11ness from three sentine1 hospita1s.Extracted RNA from specimens was used for inf1uenza diagnosing and genotyping with rea1-time RT-PCR.Amp1ification，sequencing and phy1ogenetic ana1ysis of HA gene were performed.Results Out of the 2 346 specimens，273（11.26%），58（2.39%）and 75（2.55%）were positive for inf1uenza A（H3N2）viruses，2009pdmH1N1 viruses and inf1uenza B viruses respective1y.We found that inf1uenza activity 1eve1 in Shanghai increased in summer during 2014 and 2015，and inf1uenza A（H3N2）virus was the main subtype. Phy1ogenetic ana1ysis based on the fu11-1ength HA gene of inf1uenza A（H3N2）virus was carried out. Comparing with the reference sequences，the inf1uenza A（H3N2）viruses predominated during Dec.2013-Jan.2014，Ju1.2014-Aug.2014，and Ju1.2015-Aug.2015 were c1assified as genetic c1ade A/Fin1and/ 385/2013-1ike（group 3C.3），A/Switzer1and/9715293/2013-1ike（group 3C.3a）and A/Hong Kong/ 5783/2014-1ike（group 3C.2a）respective1y.And the mutations of amino acid sequences of HA between the three epidemic strains were main1y 1ocated in antigenic epitopes and receptor binding site.Conclusion The inf1uenza epidemic in Shanghai caused by H3N2 virus may be due to the antigenic changes of inf1uenza A （H3N2）virus during 2012 to 2015.

Inf1uenza A（H3N2）virus；Antigenic drift

“十二五”国家科技重大专项（2012ZX10004-211，2014ZX10004002-003-004）；国家高技术研究发展计划863项目（2014AA021403）；长三角科技联合攻关项目（14495810302）

胡芸文，Emai1：ywhu0117@126.com；袁正宏，Emai1：zhyuan@shaphc.org

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.006

2016-01-06）