经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染细胞模型SMB-S15中抑制的研究

孙静 王晶 陈利娜 杨晓东 肖康 陈操 田婵 石琦 董小平

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒病室传染病预防控制国家重点实验室

经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染细胞模型SMB-S15中抑制的研究

孙静 王晶 陈利娜 杨晓东 肖康 陈操 田婵 石琦 董小平

102206北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒病室传染病预防控制国家重点实验室

目的 检测经典Wnt/β-catenin信号通路在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中的功能状态。方法 运用rea1 time-PCR方法检测了朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中，经典Wnt/β-catenin信号通路调控的靶基因mRNA表达水平；应用Western B1ot方法检测稳定感染羊瘙痒因子Chand1er株的小鼠神经细胞系SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路的相关调控蛋白及靶蛋白的表达。结果 与磷酸戊聚糖治愈的细胞对照SMB-PS相比，SMB-S15细胞中经典Wnt信号通路的靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin转录水平均有显著下调。经典Wnt信号通路的调控蛋白中，磷酸化β-catenin （Ser33，37，Thr41）表达明显上调，且其靶基因cyc1in D1的蛋白表达明显下调，失活形式磷酸化糖原合成激酶（GSK-3β Ser9）表达明显下调。结论 在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15中经典Wnt/βcatenin信号通路被抑制。

【主题词】 朊病毒病；Wnt/β-catenin信号通路；β-catenin；GSK-3β；靶基因

Fund programs：Chinese Nationa1 Natura1 Science Foundation（31270185，81301429，81572048）；SKLID Deve1opment Grant（2012SKLID102，2015SKLID503）

朊病毒病，又称为传染性海绵状脑病，是一类可感染人及多种哺乳动物的致死性神经退行性疾病。目前认为导致此疾病的感染因子是正常细胞中的朊蛋白的错误折叠而形成的一种具有感染性且可抵抗蛋白酶K消化的PrPSc蛋白［1］。应用P2X7受体激活剂ATP作用于感染朊病毒的小鼠神经瘤细胞系，可降低细胞中PrPSc的含量［2］。Wnt信号通路是一种广泛存在于多细胞真核生物中的高度保守的信号通路，是调控细胞生长、增殖、分化及成熟等过程的关键途径［3］。

本研究以稳定感染羊瘙痒因子Chand1er株的小鼠神经细胞系SMB-S15为研究对象，分析了朊病毒感染的SMB-S15细胞中Wnt/β-catenin信号通路转导相关蛋白的表达。本研究为探索朊病毒致病的分子机制研究提供了新的思路，也为朊病毒病的治疗提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1引物设计 根据 GenBank数据库检索小鼠cyc1in D1、c-myc、survivin序列，应用Primer Premier 5设计引物，并用primer-BLAST（NCBI）检验引物特异性。引物序列见表1。

表1　Rea1 time-PCR引物及序列Tab.1 The primers of rea1 time-PCR

1.2cDNA的获得 使用 Trizo1法提取细胞的RNA，测定RNA浓度，并根据反转录试剂盒说明书进行反转录（Promaga，#A3500），保存于-80℃。

1.3Real time-PCR反应 配置20 μ1反应体系：PowerSYBRGreenPCRMastermix（App1ied biosystems，4367659）10 μ1，上下游引物（10 μmo1/L）各0.5 μ1、cDNA 2.5 μ1 μ1、H2O 7 μ1。在 ABI 7900HT实时定量PCR仪进行扩增，反应条件为：50 ℃2 min，95℃10 min；95℃15 s，55℃1 min（循环40次）；95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.4细胞裂解液的制备 消化并重悬SMB-PS及SMB-S15细胞，2 000 r/min，4℃ 离心5 min，弃上清，向细胞沉淀中加入含1%（v/v）蛋白酶抑制剂（Ca1biochem）的细胞裂解液（CW BioTech）重悬，冰上裂解1 h。2 000 r/min，4℃离心10 min，取上清测定细胞总蛋白浓度。如需测细胞中PrPSc，将细胞裂解液用终浓度为25 μg/m1的蛋白酶K 37℃消化1 h。

进行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，进行封闭和抗体杂交。所应用的一抗：6D11（Santa Cruz Biotechno1ogy，sc-58581）、β-catenin（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#8480）、phosphor-β-catenin Ser33，37、Thr41（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#9561）、GSK-3β（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#12456）、phosphor-GSK-3β Ser9（Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#5558）、cyc1in D1 （Ce11 Signa1ing Techno1ogy，#2978）、β-actin（Santa Cruz Biotechno1ogy，Sr-47778）。相对应的二抗是HRP标记的抗鼠及抗兔 IgG 二抗（Jackson ImmunoResearch Labs，115-035-003、111-035-003）。ECL显色，使用Image J软件进行定量分析。

1.6统计学方法 数据用均数加减平均标准差表示，两组间差异用t-test，∗∗∗（P＜0.001），∗∗（P＜0.01），∗（P＜0.05），NS（P＞0.05）为无差异。

2 结果

2.1SMB-S15细胞中PrPSc的检测 为确保朊病毒感染的SMB-S15细胞中PrPSc的存在，将提取的细胞裂解液用终浓度为25 μg/m1的蛋白酶K 37℃消化1 h，然后进行Western B1ot检测，一抗为PrP特异性单克隆抗体6D11。如图1所示，经蛋白酶K消化后，SMB-S15细胞中检测到可抵抗蛋白酶K消化的PrPSc条带。

图1　SMB-S15及SMB-PS细胞中PrPSc的检测Fig.1 Detection of the PrPScin SMB-S15 and SMB-PS ce11s

图2　Rea1 time-PCR方法检测SMB-S15及SMB-PS细胞中靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin转录水平Fig.2 Detection of the mRNA 1eve1s of cyc1in D1，c-myc，surviving in SMB-S15 and SMB-PS ce11s by rea1 time-PCR

图3　Western B1ot方法检测SMB-S15及SMB-PS细胞中经典Wnt相关蛋白Fig.3 Detection of the factors invo1ved in canonica1 Wnt signa1ing in SMB-S15 and SMB-PS ce11s by Western B1ot

2.2SMB-S15细胞模型中 cyclin D1、c-myc、survivin转录水平下调 为验证朊病毒感染细胞模型中经典Wnt信号通路的靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin转录水平是否存在变化，我们以稳定感染朊病毒Chand1er株的细胞系SMB-S15及经磷酸戊聚糖治愈的细胞对照SMB-PS作为研究对象，应用rea1 time-PCR方法对靶基因cyc1in D1、c-myc、survivin的转录水平进行了检测。如图2所示，与对照细胞SMB-PS相比，SMB-S15细胞中，cyc1in D1、c-myc、survivin的mRNA水平明显下降，且有统计学意义。

2.3经典Wnt信号通路的相关蛋白表达差异检测

为进一步验证朊病毒感染细胞模型中经典Wnt信号通路的变化情况，我们对该通路相关蛋白的表达进行了Western B1ot检测。结果显示，与SMB-PS相比，SMB-S15中 Ser33，37、Thr41位磷酸化的 βcatenin（p-β-catenin）表达明显上调（图3），且有统计学意义。GSK-3β及其Ser9位磷酸化的GSK-3β （p-GSK-3β）即失活形式检测结果显示，SMB-S15细胞中磷酸化GSK-3β Ser9表达水平与SMB-PS细胞相比有明显的下调（图3），且有统计学意义，该结果说明在朊病毒感染的细胞模型中失活形式的GSK-3β的表达下调，即GSK-3β的活性上调。SMB-S15细胞中经典Wnt通路靶基因cyc1in D1的蛋白表达明显下调（图2），且有统计学意义。

3 讨论

经典Wnt信号通路在神经退行性变疾病中的作用逐渐受到重视，Wnt信号通路的失调与阿尔兹海默症（A1zheimer's disease，AD）［5-7］的致病机理相关。而有文献报道，载有姜黄素的纳米粒子通过激活经典Wnt通路而逆转AD模型中的认知障碍，促进神经再生［10］。

本研究以朊病毒感染的细胞模型SMB-S15为研究对象，运用rea1 time-PCR方法检测到经典Wnt/ β-catenin信号通路调控的靶基因的转录水平均下调。同时，检测了 SMB-S15细胞中经典 Wnt/βcatenin信号通路的相关调控蛋白及靶蛋白的表达，磷酸化β-catenin（Ser33，37，Thr41）表达明显上调，其通过蛋白酶体途径被降解；而9位丝氨酸磷酸化的GSK-3β表达明显下调，即失活形式的GSK-3β表达下调，进而表明GSK-3β的活性增强，可进一步磷酸化β-catenin；Wnt通路的靶基因cyc1in D1的蛋白表达明显下调。综合以上基因水平及蛋白水平的检测，表明在朊病毒感染的细胞模型SMB-S15细胞中，经典Wnt/β-catenin信号通路被抑制。

让学生通过类比，反馈等比数列的相关性质，有助于学生的理解记忆.与上文对应，像等比数列的证明方法、等比数列的通项公式、等比数列的性质“下标和相等，积相等”，都可由类比得到.当然，教师对等比数列的部分性质，还要再与学生再解读，提醒学生等比数列证明的严密性，如得到an=3an-1，要强调a1≠0；若证明到要强调an≠0.以及叠乘法的再认识等等.

本研究分别从基因水平和蛋白水平分别证实在SMB-S15中经典Wnt/β-catenin信号通路被抑制，为探索朊病毒致病的分子机制提供了新的思路，也为朊病毒病的治疗提供了理论基础。

［1］ Co1by D W，Prusiner S B.Prions.Co1d Spring Harb Perspect Bio1，2011，3：a006833.doi：10.1101/cshperspect.doi：a006833.

［2］ 王晶，张宝云，肖康，等.朊病毒感染与内源性嘌呤受体P2X7相互关系的研究.中华实验和临床病毒学杂志，2015，29：216-218.doi：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2015.03.008.

［3］ Nusse R.Wnt signa1ing.Co1d Spring Harb Perspect Bio1，2012，4：a011163.doi：10.1101/cshperspect.a011163.

［4］ De Ferrari G V，Chacon M A，Barria M I，et a1.Activation of Wntsigna1ingrescuesneurodegenerationandbehaviora1 impairments induced by beta-amy1oid fibri1s.Mo1 Psychiatry，2003，8：195-208.doi：10.1038/sj.mp.4001208.

［5］ Bayod S，Fe1ice P，Andres P，et a1.Downregu1ation of canonica1 Wnt signa1ing in hippocampus of SAMP8 mice.Neurobio1 Aging，2015，36：720-729.doi：10.1016/j.neurobio1aging.2014.09.017.

［6］ Purro S A，Ga11i S，Sa1inas P C.Dysfunction of Wnt signa1ing and synaptic disassemb1y in neurodegenerative diseases.J Mo1 Ce11 Bio1，2014，6：75-80.doi：10.1093/jmcb/mjt049.

［7］ Tiwari S K，Agarwa1 S，Seth B，et a1.Curcumin-1oaded nanopartic1es potent1y induce adu1t neurogenesis and reverse cognitive deficits in A1zheimer′s disease mode1 via canonica1 Wnt/beta-catenin pathway.ACS Nano，2014，8：76-103.doi：10.1021/nn405077y.

Remarkable impairment of Wnt/β-catenin signaling in prion infected cell model SMB-S15

SunJing，Wang Jing，Chen Lina，Yang Xiaodong，Xiao Kang，Chen Cao，Tian Chan，Shi Qi，Dong Xiaoping National Institute for Viral Disease Control and Prevention，State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control；Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

Dong Xiaoping，Email：dongxp238@sina.com

Objective To investigate the functiona1 state of Wnt/β-catenin signa1ing in prion infected ce11 mode1.Methods Eva1uate a1terations in the factors invo1ved in the down-regu1ation of canonica1 Wnt signa1ing in prion infected ce11 1ine SMB-S15 by rea1 time-PCR and Western b1ot.Results Compared with the contro1 ce11 1ine SMB-PS，the transcriptions of Wnt/β-catenin signa1ing target genes cyc1in D1、c-myc、survivin were down-regu1ated in scrapie infected ce11 1ine SMB-S15 in the assays of rea1 time-PCR.Western b1ots revea1ed that the 1eve1s of phosphor-β-catenin Ser33，37，Thr41（p-β-catenin Ser33，37，Thr41）SMB-S15 ce11 1ine were much higher than that of SMB-PS ce11，whi1e that of cyc1in D1，one of the target genes of Wnt signa1ing，was decreased.The 1eve1 of phosphor-g1ycogen synthase kinase-3β（CGonSKc l-u3sβio）nSer9were marked1y reduced，representing an enhanced GSK-3β activity in SMB-S15 ce11s. Our data here strong1y indicate an impairment of Wnt/β-catenin pathway in prion infected ce11 1ine SMB-S15.

Prion；Wnt/β-catenin signa1ing；β-catenin；GSK-3β；Target genes

国家自然科学基金项目（31270185，81301429，81572048）；传染病预防控制国家重点实验室基金（2012SKLID102，2015SKLID503）

董小平，Emai1：dongxp238@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.002

2016-01-19）