α-2，6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒的筛选

董方圆 王昕 丁小满 彭博 武伟华 刘慧 耿艺介 郑青 房师松

510632广州，暨南大学药学院（董方圆、郑青）；510632广州，中山大学公共卫生学院（丁小满）；518055深圳市疾病预防控制中心（王昕、彭博、武伟华、刘慧、耿艺介、房师松）

α-2，6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒的筛选

董方圆 王昕 丁小满 彭博 武伟华 刘慧 耿艺介 郑青 房师松

510632广州，暨南大学药学院（董方圆、郑青）；510632广州，中山大学公共卫生学院（丁小满）；518055深圳市疾病预防控制中心（王昕、彭博、武伟华、刘慧、耿艺介、房师松）

目的 筛选与α-2，6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒。方法 运用随机突变技术处理A/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒HA蛋白头部受体结合域；用反向遗传学技术将其NA基因和突变的HA基因与A/PR/8/34（H1N1）流感病毒的6个内部基因进行基因重组，构建H7N9流感病毒突变病毒库。并用α2-3唾液酸酶处理的红细胞筛选与α-2-6唾液酸受体结合特性的H7N9流感病毒。结果 筛选出3种类型与α-2，6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒突变株。突变位点分别为I126V、S194P/A435S、D127V/S136G/A169T。结论 从构建的H7N9流感病毒突变病毒库中成功筛选出与α-2，6唾液酸受体结合特异性的H7N9流感病毒。

【主题词】 H7N9流感病毒；随机突变技术；反向遗传学

Fund programs：Shenzhen Science and Techno1ogy P1anning Projects（JCYJ20140410164811662）

自2013年3月，我国首次发现人感染H7N9流感病毒病例以来，该病毒对人的感染逐渐扩散至我国多省，给我国公共卫生带来严峻的挑战，通常该病毒以低致病性状态稳定存在于家禽中，但人感染后会引起重症肺炎及多器官衰竭，死亡，严重地威胁着人们的健康。目前H7N9禽流感病毒在哺乳动物间不能持续传播，但是一旦它在自然界中获得在人间有效传播的变异或重配，将会给人类带来不可估量的损失［1］。

流感病毒的跨物种传播能力主要取决于HA蛋白受体结合区域，主要包括130环、190螺旋和220环［2］。通常人流感病毒的HA特异地与Saα2-6Ga1受体结合，而禽流感病毒的HA特异地与Saα2-3Ga1受体结合。已有研究发现HA受体结合区氨基酸位点的突变，使H5N1禽流感病毒，不但能特异性的选择Saα-2，6Ga1，还可以在雪貂之间传播［3］。本实验采用随机突变和反向遗传技术，通过对HA蛋白受体结合区域随机突变，构建以PR8内部基因为骨架的H7N9流感病毒随机突变病毒库，并初步筛选出与α-2-6受体结合特性的H7N9流感病毒，为进一步探讨H7N9流感病毒在哺乳动物中有效传播的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1病毒株、鸡胚和细胞株 A/Human/Shenzhen/ 1/2013（H7N9）流感病毒源于深圳市疾病预防控制中心病毒库，保存于-80℃。鸡胚SPF级、MDCK细胞、293T细胞由深圳市疾病预防控制中心提供。

1.2质粒和载体 反向遗传系统pCDNA-RG［4］由本实验室自行构建；pGEM-T easy vector购自于Promega公司。

1.3引物设计与合成 根据A/Human/Shenzhen/ 1/2013（H7N9）HA基因序列设计一对HA基因RTPCR扩增引物，序列如下：Bm-H7N9-HA：5′-TAC GTCTCCGGGAGCAAAAGCAGGGGAT-3′；Bm-HAH7N9-1732R：5′-TACGTCTCGTATTAGTAGAAACAA GGGTGTTTT-3′。引物引入BsmBI酶切位点酶切后与BsmBI酶切的pCDNA-RG载体核酸片断粘性互补。

根据已知NA基因序列设计一对NA基因RTPCR扩增引物序列如下：Ba-NA-H7N9：5′-TAGGT CTCCGGGAGCGAAAGCAGGGTCAA-3′Ba-NA-H7N 9-1413R：5′-TAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGG GTCTTTTT-3′。引物引入BsaI酶切位点酶切后与BsmBI酶切的pCDNA-RG载体核酸片断粘性互补。因对HA蛋白120-259受体结合区域进行随机突变，根据已知HA序列采用重叠PCR技术设计引物：HA 377-411 F：5′-TTGACAAGGAAGCAATGG GATTCACATACAG TGGA-3′；HA 832-854 R：5′-TTG GCATCAACCTG TACTCCACT-3′；HA 838-871 F：5′-GTACAGGTTGATGCCAATTGTGAAGGGGACTGCT-3′；HA 382-405 R：5′-GTATGTGAATCCCATTGCTT CCTT-3′。引物均由日本TaKaRa公司合成。

1.4病毒 RNA提取和 RT-PCR的扩增 A/ Human/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒RNA用High pure vira1 RNA kit（Roche）试剂盒提取；采用One Step RT-PCR Kit（TaKaRa）对 HA和NA片段扩增。

1.5HA蛋白120-259受体结合区域随机突变 以HA序列为模板，用 TaKaRa PrimeSTAR HS DNA Po1ymerase扩增HA蛋白120-259受体结合区域、受体结合区域上游序列和下游序列。以HA 377-411 F 和HA 832-854 R为上下游引物，扩增HA蛋白120-259受体结合区域；以Bm-H7N9-HA和HA 382-405 R为上下游引物扩增受体结合区域上游序列；以HA 838-871 F和Bm-HA-H7N9-1732R为上下游引物扩增受体结合区域下游序列。以HA蛋白120-259受体结合区域为模板（650 ng）用随机突变试剂盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit（Agi1ent公司）对该片段进行随机突变，经PCR纯化试剂盒纯化后，取1 μ1与pGEM-T easy vector连接，转化，涂板，挑选20株送TaKaRa测序，计算突变库容量。根据重叠 PCR技术，以 Bm-H7N9-HA，Bm-HA-H7N9-1732R为引物用DNA Po1ymerase将所有HA受体结合区域随机突变序列与其上游和下游序列拼接成完整的HA序列［4］。

1.6HA序列、NA序列与pCDNA-RG载体连接

正常的HA（标记为HA-1）序列和拼接的突变HA（标记为HA-2）序列分别用BsmBI酶切与BsmBI酶切的pCDNA-RG载体核酸片断连接，转化感受态细胞JM109。提取质粒pCDNA-RG-HA-1（H7N9）和pCDNA-RG-HA-2（H7N9）。NA序列用BsaI酶切后与BsmBI酶切的pCDNA-RG载体核酸片断连接并转化感受态细胞JM109。提取质粒pCDNA-RG-NA （H7N9），提取质粒均送TaKaRa测序。

1.7细胞转染与病毒拯救 重组H7N9病毒的拯救，将 8质粒 pCDNA-RG-PA、pCDNA-RG-PB1、pCDNA-RG-PB2、pCDNA-RG-NS、pCDNA-RG-NP、pCDNA-RG-M与 pCDNA-RG-HA（H7N9）、pCDNARG-NA（H7N9）各1 μg，加入无血清、无抗生素的Opti-MEM细胞培养液使总体积为250 μ1，取32 μ1脂质体 1ipofectamine 2 000加入到218 μ1的Opti-MEM细胞培养液中，混合均匀室温静置5 min，与已加入质粒的250 μ1 Opti-MEM细胞培养液混合作用20 min，再加入Opti-MEM细胞培养液2.5 m1使总体积为3 m1，转染进入含有293T和MDCK两种细胞 （细胞生长至形成致密的单层，两种细胞各占50%）的6孔板中。在37℃、5%CO2培养箱培养6 h，换成含有10%FBS的 DMEM完全培养基于37℃、5%CO2培养箱培养24 h，换成接种液（含有5 μg/m1 TPCK-trypsin的 DMEM细胞培养液）在35℃、5%CO2培养箱继续培养。72 h后收集细胞上清液，做血凝试验检测血凝效价［5］。转染细胞时做阳性对照（拯救毒株A/PR/8/34（H1N1）的8个质粒）和阴性对照（不含pCDNA-RG-HA、pCDNA-RGNA的六个质粒）。

1.8接种鸡胚扩大培养病毒 拯救出的重组病毒命名为rH7N9，将rH7N9病毒转染上清液接种到两枚9日龄的 SPF鸡胚尿囊腔，每只鸡胚接种 200 μ1，37℃孵化72 h后收集尿囊液，测定血凝效价，保存于-80℃。

1.9红细胞处理与病毒筛选 取豚鼠血，加入阿氏液中，PBS洗涤3次，用PBS配成20%的红细胞悬液，取 1 m1加入 1000 U的 α2，3 Neuraminidase （NEB）于37℃敷育20 h，PBS洗涤3次，用含有1% BSA的PBS配成10%的α2-3唾液酸酶处理的红细胞悬液。突变的病毒与100 μ1此红细胞悬液在4℃敷育10 min，含有1%BSA的PBS洗涤10次。病毒在MDCK扩大培养后，噬斑纯化挑取单病毒测序。

1.10噬斑试验与噬斑纯化试验 取筛选后培养的病毒液用DMEM做1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000的比例稀释，将病毒取1 m1/每孔加入长至90%的MDCK细胞6孔板中。37℃孵育2 h后，弃掉接种液，PBS洗涤2次，加入含有1%低熔点琼脂糖的无酚红DMEM接种液（胰酶终浓度为5 μg/ m1），30 min凝固后，将6孔板倒置于35℃、5%CO2培养箱中培养，72 h后观察空斑，染色处理（10%甲醛固定2 h、1%结晶紫处理1 min、水流冲洗），根据噬斑实验结果选择合适的稀释比例进行噬斑纯化实验，噬斑纯化与噬斑实验相同只是不再进行染色。直接挑选空斑接种到90%的MDCK的96孔板培养72 h，逐步扩大到24孔板、6孔板中培养，做血凝试验检测血凝效价［6］。收毒提取病毒RNA，RT-PCR扩增HA片段，送TaKaRa公司测序。

1.11病毒受体结合特异性检测 通过固相受体检测方法对分离得到的突变株进行受体结合特异性检测。病毒纯化，PBS将4种病毒稀释到血凝效价64后，加入96孔高效结合微孔板50 μ1/孔，PBS做阴性对照，4℃过夜，100 μ1 1%BSA的PBS封闭2 h，PBS洗3遍，分别加入不同浓度的3′SLN-PAA和6′SLN-PAA，100 μ1/孔，37℃避光孵育2 h。PBST洗3遍，加入Streptavidin-HRP、100 μ1/孔，37℃避光孵育2 h，PBST洗3遍。加入 TMB显色液、100 μ1/孔，37℃避光孵育25 min后加入终止液，检测450 nm波长吸光度。

1.12病毒繁殖动力学实验 将H7N9以及3种突变的病毒，将病毒按照MOI=0.001稀释后，分别接种的MDCK细胞中进行培养，放在35℃5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每天取上清于-80℃冻存。培养7天后，进行血凝实验，记录血凝实验结果。

1.13生物安全 本实验在深圳市疾病预防中心，微生物检验楼生物安全三级实验室进行。

A：1-2空白对照和HA（120-259）受体结合区域上游序列；3-4空白对照和HA（120-259）受体结合区域序列；5-6空白对照和HA（120-259）受体结合区域序列下游序列；B：1空白；2随机突变的HA（120-259）序列；C：1 HA基因融合片段（1 732 bp）；2空白；M DL2000 bp DNA Marker图1　重叠PCR和易错PCR凝胶电泳结果A：1-2 Contro1 and the upstream sequence of HA（120-259）receptor binding region；3-4 Contro1 and the sequence of HA receptor binding region；5-6 Contro1 and the upstream sequence of HA receptor binding region；B：1-2 Contro1 and random mutation sequence of HA（120-259）；C：1-2 Fusion PCR products of recombinant HA sequence（1 732 bp）and contro1；M DL2000 bp DNA MarkerFig.1 The resu1t of error-prone PCR and over1ap-PCR agarose ge1 e1ectrophoresis

2 结果

2.1HA蛋白120-259受体结合区域随机突变 库容量计算1 μ1（共100 μ1）目的片段连接后体系为10 μ1，取2 μ1转化，白斑阳性克隆4088个，阴性对照无阳性克隆。随机挑选20株测序，共有13株序列突变位点完全不同、7株没有突变。突变率为65%。突变库容量：阳性克隆×突变率×转化次数×总体积=4088×65% ×5×100=1.33×106（cfu/ 100 μ1）=1.33×107cfu/m1。

2.2重组质粒的构建 H7N9的HA基因与NA基因与pCDNA-RG连接，转化大肠埃希菌JM109，挑取单菌落进行PCR扩增HA和NA序列。阳性质粒送TaKaRa公司测序，测序结果表明HA和NA序列均成功克隆到pCDNA-RG载体上。

2.3重组病毒拯救结果和鸡胚扩大培养血凝效价

转染293T和MDCK细胞换成接种液培养72 h后，细胞出现明显病变，细胞培养上清中rH7N9流感病毒血凝效价为1∶16；阳性对照H1N1流感病毒的血凝效价为1∶64；阴性对照孔无细胞病变，细胞培养上清血凝效价为0。接种鸡胚72 h后收集尿囊液，进行血凝实验，对照H1N1流感病毒血凝效价为1∶128、rH7N9流感病毒血凝效价为1∶64（如图2）。

A：细胞上清的血凝效价：C：空白；1：H1N1流感病毒；2-4：重组H7N9流感病毒；B：鸡胚尿囊液的血凝效价：1：H1N1流感病毒；2-4：重组H7N9流感病毒图2　拯救病毒的血凝效价结果A：HA titer of ce11 supernatant；C：Contro1；1：HA titer of H1N1 inf1uenza virus；2-4：HA titer of rH7N9 inf1uenza virusB：HA titer of the chicken embryo a11antoic f1uid.；1 H1N1 inf1uenza virus；2-4：rH7N9 inf1uenza virusFig.2 Hemagg1utination titer of rescued inf1uenza virus

2.4噬斑试验 经α2-3唾液酸酶处理的豚鼠血细胞筛选的 H7N9流感病毒经扩大培养后从10-1-10-5依次稀释做噬斑试验（图3），以此作先导实验以确认合适噬斑纯化浓度。根据先导实验选择将病毒稀释10-3来进行噬斑纯化。

行：1-3：均为rH7N9禽流感病毒列：从左至右H7N9流感病毒稀释倍数依次为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5图3　rH7N9流感病毒空斑实验结果Line：1-3：A11 are rH7N9 inf1enza virus；Co1umn：From 1eft to right seria1 10-fo1d di1utions of rH7N9 inf1enza virus：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5Fig.3 P1aque assay of rH7N9 inf1enza virus

表1　测序结果突变分析Tab.1 Mutation ana1ysis of the sequencing resu1ts

图4　各流感病毒分离株的受体结合特性Fig.4 Characterization of the receptor-binding properties of iso1ated viruses

图5　H7N9流感病毒分离株的体外增殖曲线Fig.5 In vitro pro1iferation curve of iso1ated H7N9 inf1uenza viruses

2.5噬斑纯化试验及序列测定 经噬斑纯化试验，共分离到15株rH7N9流感病毒。分别提取15株rH7N9病毒总RNA，RT-PCR扩增HA基因并进行序列测定。rH7N9与A/Shenzhen/1/2013（H7N9）流感病毒的HA基因序列比对，发现有14株rH7N9发生突变。具体突变位点如表1。其中第1、2、3、4、5、6株rH7N9 HA基因突变类型一致，为S194P和 A435S；第7株没有突变；第8株rH7N9 HA基因突变位点为，I126V；第 9、10、11、12、13、14、15株rH7N9 HA基因突变类型一致，为D127V、S136G和A169T；总共得到3种类型的突变株，NCBI上分析发现在现有毒株中均没有发现这些突变株的存在。

2.6糖苷固相受体结合试验 对筛选得到的3种类型的H7N9流感病毒突变株以及H7N9未突变株分别做固相受体结合试验，实验结果如图4：与H7N9未突变株相比，I126V突变株对α-2，6唾液酸受体和α-2，3唾液酸受体的结合能力影响不大。S194P/A435突变株与D127V/S136G/A169T突变株均增强了对α-2，6唾液酸受体结合能力，而且D127V/S136G/A169T突变株的对α-2，6唾液酸受体结合能力要大于对α-2，3唾液酸受体结合能力。

2.7病毒繁殖动力学试验 对3株突变株H7N9 与rH7N9阳性株分别做繁殖动力学实验，发现在前4 d，3株突变株的体外复制能力均 ＞rH7N9。D127V/S136G/A169T毒株的体外复制能力要高于其他毒株。5天后，病毒滴度均趋于平稳状态。研究结果说明受体结合区域的突变会影响病毒的体外增殖，我们筛选的3株H7N9初期均在一定程度上提高病毒的体外复制能力，后期仅D127V/S136G/ A169T突变株提高了病毒的体外复制能力。

3 讨论

已有研究发现新的H7N9禽流感病毒HA基因具有226L哺乳动物易感标记，且PB1基因的627位点为赖氨酸，通常E627K为PB2蛋白的重要毒力改变位点，PB1-F2羧基端的L62、R75、R79、L82四个位点，使得禽流感病毒具有高致病力的特征［7-8］。且体外受体结合实验表明，该病毒对Saα2-6Ga1和Saα2-3Ga1受体均能结合，与Saα2-3Ga1受体结合能力大于Saα2-6Ga1受体［9］。目前还未发现人传人的案例，该病毒对人类来说还是新型的病毒，人体还没有对其产生有效的免疫体制［10］。2011年Yoshihiro Kawaoka等通过对H5N1禽流感病毒的HA（氨基酸位点120-259）受体结合区域随机突变，逐步发现HA基因序列上某些氨基酸位点的改变，不但能够增强H5N1禽流感病毒与Saα2-6Ga1受体的结合能力，还能够使流感病毒在雪貂模型中有效传播［3］。基于此，通过对H7N9流感病毒的HA头部受体结合区域进行随机突变，构建H7N9流感病毒突变病毒库。

豚鼠血细胞表面具有Saα2-6Ga1受体和Saα2-3Ga1受体，Saα2-6Ga1受体要远多于Saα2-3Ga1受体［11］。本研究用过量的α2-3唾液酸酶处理掉豚鼠血细胞表面Saα2-3Ga1受体，使豚鼠血细胞仅具有Saα2-6Ga1受体，进而用该处理的红细胞进行筛选与Saα2-6Ga1受体特异性结合的H7N9流感病毒。本研究共筛选4株，一株是没有突变的毒株，这点与病毒本身能与α2-6Ga1受体结合相一致。测序结果显示突变位点多数在HA受体结合部位，也有部分突变在其他位点，这可能是病毒为能更好的适应相应的突变体系而做出的自身突变。本研究初步筛选3株对α-2，6受体结合特异性的H7N9流感病毒，且S194P/A435S突变株与D127V/S136G/A169T突变株均在体外水平上增强了对α2-6Ga1受体结合能力。D127V/S136G/A169T突变株的体外增殖能力也有一定提高，下一步我们可以通过雪貂模型实验研究突变株的体内感染动力学和有效传播，从HA 3D结构生物学，膜融合PH依赖实验和温度耐受实验，进一步研究突变体对α2-6Ga1受体结合特异性的分子机制。

本研究提供了初步筛选α-2，6受体结合特异性的H7N9流感病毒的平台，有助于了解某些位点的改变会增加病毒与人受体结合的能力，提高我们对H7N9禽流感病毒变化的检测能力，有助于我们应对可能出现的H7N9在人类传染中的变化。

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Screening of H7N9 influenza virus with alpha 2，6 receptors bindin
g preference

Dong Fangyuan，Wang Xin，Ding Xiaoman，Peng Bo，Wu Weihua，Liu Hui，Geng Yijie，Zheng Qing，Fang Shisong Department of medicine，Jinan University，Guangzhou 510322，China（Dong FY，Zheng Q）；Shenzhen Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen 518055，China（Ding XM）；School of Public Health，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou 510322，China（Wang X，Peng B，Wu WH，Liu H，Geng YJ，Fang SS）

Fang Shisong，Email：szcdcssf@aliyun.com；Zheng Qing，Email：tzhengq@jnu. edu.cn

ObjectiveScreening of H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference.Methods We introduced random mutations into the g1obu1ar head of A/Shenzhen/1/2013 （H7N9）HA.And then，to generate a reassortant H7N9 virus 1ibrary，p1asmids for the synthesis of the mutated HA gene and the unmodified NA gene of H7N9 were transfected into 293T and MDCK ce11s together with p1asmids for the synthesis of the six remaining vira1 genes of A/Puerto Rico/8/34（H1N1）.We screened reassortant H7N9 inf1uenza virus by RBCs treated with α2-3Neuraminidase.Results We screened three strains of reassortant H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference in this study. Mutation sites of three variants are I126V，S194P/A435S and D127V/S136G/A169T.Conclusion We successfu11y screen the reassortant H7N9 inf1uenza virus with a1pha 2，6 receptors binding preference from H7N9 virus 1ibrary.

H7N9 inf1uenza virus；Random mutagenesis；Reverse genetics

深圳市科技计划项目（JCYJ20140410164811662）

房师松，Emai1：szcdcssf@a1iyun.com；郑青，Emai1：tzhengq@jnu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.004

2016-01-20）