人副流感病毒3型HN糖蛋白受体结合位点中保守氨基酸突变分析

褚福禄 温红玲 王志玉

250012济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室（褚福禄，温红玲，王志玉）；250021济南，山东大学附属省立医院检验科（褚福禄）；教育部实验畸形学重点实验室（王志玉）

人副流感病毒3型HN糖蛋白受体结合位点中保守氨基酸突变分析

褚福禄 温红玲 王志玉

250012济南，山东大学公共卫生学院病毒学研究室（褚福禄，温红玲，王志玉）；250021济南，山东大学附属省立医院检验科（褚福禄）；教育部实验畸形学重点实验室（王志玉）

目的 研究人副流感病毒3型（hPIV3）HN受体结合位点中保守氨基酸功能。方法采用定点突变与同源重组相结合方法将HN受体结合位点中的7个保守氨基酸突变为丙氨酸（A），分别为R192A、D216A、E409A、R424A、R502A、Y530A和E549A，各突变株在BHK-21细胞内表达并测定其免疫沉淀反应、蛋白表达效率、促细胞融合、受体结合和神经氨酸酶活性。结果 各突变株在BHK-21细胞内折叠加工正常并成功转运到细胞膜，其膜表面蛋白表达率与野毒株相比差别无统计学意义；各突变株促细胞融合活性不同程度下降，R502A降低最多，为野毒株的14.2%；各突变株受体结合活性也不同程度降低，突变株吸附豚鼠红细胞与吸附人红细胞的能力大体一致；各突变株神经氨酸酶活性变化程度不同，R502A下降最多，为18.6%；E549A下降最少，为94.9%。结论 hPIV3 HN蛋白受体结合位点中的保守氨基酸对HN的促细胞融合活性有重要作用，第502位精氨酸（R）是关键氨基酸。

【主题词】 副流感病毒3型，人；HN蛋白质；细胞融合；血细胞吸附；神经氨酸酶

【Key words】Human parainf1uenza virus type 3；HN protein；Ce11 fusion；Hemadsorption；Neuraminidase

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Foundation of China（30970142，81271806）；Scientific Foundation of Innovative Research Team in Shandong University

人副流感病毒3型（human parainf1uenza virus type 3，hPIV3）是引起婴幼儿下呼吸道感染的重要病原［1］，也是引起老年人和免疫功能缺陷者致死的病原之一［2］，目前无特效的治疗手段［3］。hPIV3感染宿主需要血凝素神经氨酸酶（HN）和融合（F）蛋白共同参与。与细胞膜表面的唾液酸受体结合的HN蛋白激活F蛋白介导病毒包膜和宿主细胞膜融合，病毒借此进入细胞内引起机体感染［4］。但HN激发F蛋白促进膜融合过程不清楚。本研究将HN蛋白受体结合位点中的7个保守氨基酸突变为丙氨酸检测功能，表明hPIV3 HN蛋白受体结合位点中的保守氨基酸对激发F蛋白介导膜融合起重要作用。

1 材料与方法

1.1病毒、质粒、工具酶和试剂 痘苗病毒野毒株、重组株vTF7-3由Moss教授（美国国家过敏和传染病研究所）惠赠。pB1uescript SK（+）（pBSK+），含有hPIV3-HN，hPIV3-F和PG1NT7β-Ga1质粒由Iorio教授（美国麻省大学医学院）惠赠。

1.2引物 应用Primer 5软件设计引物，见表1。

1.3痘苗病毒-T7瞬时表达系统 每孔4×105个BHK-21细胞接种6孔板，24 h后每孔接种1 m1 1∶100稀释的vTF7-3，37℃孵育1 h，1 μg质粒转染BHK-21细胞［5］，pBSK+为阴性对照，野毒株为阳性对照。

1.4各突变株免疫沉淀反应 各突变株与交联在磁珠protein A（invitrogen）的小鼠抗hPIV3 HN蛋白单克隆抗体（Abcam M02122321）混合，10%SDSPAGE，曝光2 h后扫描，Perkin E1mer Cyc1one P1us分析。

1.5各突变株表达强度 一抗为小鼠抗hPIV3 HN蛋白单克隆抗体（1∶20稀释），二抗为FITC标记山羊抗小鼠 IgG（中杉金桥，ZF-0312）（1∶50稀释），Becton Dickinson流式细胞仪分析蛋白表达率（FACS）。

1.6各突变株促细胞融合活性测定 第一系列：每孔接种1 m1 1∶100稀释的 vTF7-3，各突变体与hPIV3-F质粒共转染；第二系列：每孔接种1 m1 1∶100稀释的痘苗病毒野毒株，PG1NT7β-Ga1质粒转染；两系列各1×105个细胞混匀加入96孔板，20 μ1上清与 130 μ1 1.5 mg/m1氯氛红-β-D-半乳糖苷（Stratagene）反应30 min后，570 nm酶联免疫分光光度仪测定吸光度（A）［6］。

1.7各突变株受体结合活性测定 每孔加2%的豚鼠或人或鸡的红细胞稀释液，4℃吸附30 min，洗涤后加0.05 mmo1/L的NH4C1溶液，静置1 h取上清，540 nm下测定A值。

1.8神经氨酸酶活性测定 每孔加0.5 m1 0.625 g/m1的唾液乳糖钠盐（Invitrogen），转移至试管，加0.5 m1高碘酸（0.025 mo1/L），0.4 m1 2%的亚砷酸钠溶液，2 m1硫代巴比妥酸溶液（0.1 mo1/L）和1 m1酸性丁醇，3000 r/min离心15 min，549 nm测定A值［9］。

2 结果

2.1构建hPIV3 HN突变体 同源末端的两个PCR产物共转化感受态TG1菌，经DNA测序，成功构建7个突变体。

2.2各突变株免疫沉淀反应 各突变株泳带宽度和速率与野毒株大体一致（图1）。

图1　hPIV3 HN蛋白及其突变株免疫沉淀电泳图Note：WTHN represents wide-type HN protein of hPIV3Fig.1 E1ectrophoresis after immunoprecipitation of hPIV3 HN g1ycoprotein and its mutant proteins

2.3各突变株蛋白表达率 各突变株蛋白表达率与野毒株相比差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

2.4各突变株促细胞融合活性 消除蛋白表达效率影响，各突变株促细胞融合活性不同程度降低别（P＜0.01），R502A最低，为野毒株的14.2%，第502位精氨酸（R）是关键氨基酸（表2）。

2.5各突变株受体结合活性 野毒株及突变株能吸附豚鼠和人红细胞，不能吸附鸡红细胞。各突变株吸附豚鼠红细胞能力不同程度降低（P＜0.05），各突变株吸附人与吸附豚鼠红细胞能力大体一致（表2）。

2.6各突变株神经氨酸酶活性 消除蛋白表达效率影响，除E549A各突变株的神经氨酸酶活性不同程度降低（P＜0.05）（表2）。

表1　hPIV3 HN蛋白受体结合位点内保守氨基酸突变所用引物Tab.1 PCR primer sequences used in site-directed mutagenesis of mutations in the receptor-binding domain of hPIV3 HN protein

3 讨论

膜融合是hPIV3增殖与感染的关键步骤，也是其感染细胞的典型病理特征。hPIV3引起膜融合需要F和同源HN蛋白协同完成［8］。目前hPIV3引起膜融合机制为：HN蛋白结合唾液酸受体后其构型改变，引起F蛋白构型改变，F蛋白暴露融合肽插入细胞膜中，引起膜融合［9］。但目前对HN与受体结合后促进F蛋白介导膜融合过程不清楚。

本研究对hPIV3 HN蛋白受体结合位点中7个保守氨基酸进行突变，突变后未影响蛋白折叠加工，转运到细胞膜表面及其表达效率与野毒株大体一致，但受体结合、神经氨酸酶和促细胞融合活性都不同程度下降。HN蛋白受体结合活性降低可能导致F蛋白融合肽不能充分暴露，且神经氨酸酶活性损失导致HN蛋白切割受体能力降低，HN蛋白大多与唾液酸受体连接聚集在原细胞膜不参与其他细胞膜融合，引起膜融合程度降低。R502A促细胞融合活性降低最多，为野毒株的14.2%，E549A促细胞融合活性降低最少，也损失了三分之一活性。推测HN蛋白促细胞融合活性可能与氨基酸位置有关。HN蛋白结构具有6个β折叠，R192、D216位于第1 个β折叠，Y530、E549位于第6个β折叠，Takimoto等研究表明，第1和第6个β折叠的氨基酸位于疏水区附近，对促细胞融合活性起重要作用［11］。HN蛋白有一个“受体结合口袋”，有结合受体功能［12］。R424、R502与R192构成的三条精氨酸侧链位于“受体结合口袋”一端，对受体结合活性有重要作用［10］。E409通过氢键与Y530和R424相连，稳定“受体结合口袋”结构，其突变也影响HN蛋白受体结合活性。野毒株和突变株不能吸附鸡红细胞，但对豚鼠和人红细胞的吸附能力大体一致，说明鸡红细胞与豚鼠和人红细胞膜表面的唾液酸受体结构不同，HN蛋白不能结合，而豚鼠和人红细胞的的唾液酸受体结构相似，都能结合HN蛋白。hPIV3 HN蛋白转运到细胞膜表面时，HN蛋白与唾液酸受体相连，受体结合位点突变导致HN蛋白转换成具有完整神经氨酸酶活性的野毒株构型受阻，HN蛋白无法参与以后的膜融合过程，影响膜融合程度［10］。

表2　hPIV3 HN各突变体功能测定结果Tab.2 Functiona1 ana1ysis of hPIV3 HN and its mutants

总之，hPIV3 HN蛋白的受体结合位点对膜融合起重要作用。我们将进一步完成HN蛋白其他功能区域检测，探讨hPIV3 HN蛋白促细胞融合机制。

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Mutational analysis of conserved amino acids in the receptor-binding domain of human parainfluenza virus type 3 hemagglutinin-neuraminidase protein

Chu Fulu，Wen Hongling，Wang ZhiyuDepartment of Virology，School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China（Chu FL，Wen HL，Wang ZY）；Department of Laboratory Medicine，Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Jinan 250021，China（Zhu FL）；Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education，Jinan 250012，China（Wang ZY）

Wang Zhiyu，Email：zhiyu.wang@sdu.edu.cn

Objective To determine the functions of conserved amino acids in the receptor-binding domain of human parainf1uenza virus type 3（hPIV3）hemagg1utinin-neuraminidase（HN）protein.Methods Using a PCR-based site-directed mutagenesis method and the method of homo1ogy recombination occurred in vivo to change seven conservative amino acids into a1anine respective1y，we named them as R192A，D216A，E409A，R424A，R502A，Y530A and E549A.Wi1d type（wt）and a11 mutant HN proteins were expressed on the ce11 surface of BHK-21 ce11s.Protein fo1ding and processing，ce11 surface expression，ce11 fusion efficiency，receptor binding activity and neuraminidase activity were determined.Results WT and each mutant HN protein were fo1ded and processed efficient1y and expressed on the ce11 surface of BHK-21 ce11s. There was no statistic difference of ce11 surface expression between WT and each mutant HN protein.Ce11 fusion efficiency of each mutant protein decreased to some extent，especia11y R502A to 14.2%.The binding guinea pig erythrocytes activity of each mutant protein was corresponding to its binding human erythrocytes activity.There was different neuraminidase activity among each mutant HN protein.R502A decreased most to 18.6%，but the neuraminidase activity of E549A was simi1ar to that of WT hPIV3 HN（94.9%）. Conclusion Conserved amino acids in the receptor-binding domain of hPIV3 HN protein p1ay an important ro1e in ce11 fusion.R502 is a key amino acid.

国家自然科学基金（30970142，81271806）；山东大学创新团队资助项目

王志玉，Emai1：zhiyu.wang@sdu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.005

2013-01-13）