秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的研究

毕爽　胡淦海　胡丹丹　姜远英　王彦

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)



秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的研究

毕爽胡淦海胡丹丹姜远英王彦

(中国人民解放军第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

目的观察秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的可靠性和稳定性，评价该模型在抗真菌药物研发中的应用价值。方法使线虫吞食白念珠菌造成致死性感染，建立线虫-白念珠菌感染模型，选用4种临床常见的抗真菌药物 (氟康唑、两性霉素B、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶)和白念珠菌群体感应分子法尼醇对感染后线虫进行治疗，观察线虫存活状态，记录生存率从而评价抗真菌药效。结果白念珠菌感染线虫后生成菌丝穿破线虫体表造成线虫死亡。氟康唑、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶治疗后线虫体内白念珠菌菌丝生长呈现不同程度的抑制状态，线虫生存率有提高且存在量效关系。两性霉素B在该模型中也表现出了明显的体内抗真菌作用，但16 μg/mL、32 μg/mL的高浓度两性霉素B表现出毒性。法尼醇能够抑制线虫体内白念珠菌菌丝形成，但对线虫保护作用较弱。结论秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于体内抗真菌药效评价方法可靠，并具有通量高、成本低、周期短等优点，值得推广应用。

秀丽隐杆线虫；白念珠菌；感染模型；抗真菌药物

[Chin J Mycol，2016，11(3):135-139]

随着器官移植、侵入性诊疗技术的发展，免疫抑制剂的广泛使用，以及艾滋病传播，侵袭性白念珠菌感染已成为临床免疫力低下患者最主要的死亡原因之一。临床现有抗真菌药物品种有限，同时临床白念珠菌耐药性也给治疗带来了极大挑战，研发新型抗真菌药物迫在眉睫。

传统的抗真菌药物体外筛选和小鼠体内药效评价都存在不尽人意之处。传统体外药物敏感性实验 (微量液基稀释法)无法模拟体内环境，大量化合物的抗真菌作用源于其毒性，细胞或者分子水平高通量筛选出的抗真菌化合物一旦进入动物实验阶段常被宣判无效或因毒性过大而被淘汰出局，造成人力物力的巨大浪费。传统哺乳动物体内药效评价模型 (如小鼠菌血症模型)周期长、效率低、成本高，无法满足药物研发前期高通量筛选的需要。

秀丽隐杆线虫 (简称线虫)模型有望成为同时观察抗真菌药物疗效和毒性的高通量动物模型。秀丽隐杆线虫雌雄同体，以细菌为食物，25℃下仅3 d即可由幼虫成长为成虫，成虫长约1 mm，一块普通的9 cm培养皿即可培养300～600只线虫[1]。线虫已成为现代发育生物学、遗传学和基因组学研究的重要模式生物，Mylonakis实验室成功将该线虫作为宿主研究病原真菌的致病性[2-4]。该线虫模型与我国现有的小鼠模型相比，具有周期短、成本低、通量高的优势。在本研究中，我们综合国内外研究结果，选择了4种临床常用的抗真菌药物，并增加同样具有抑制菌丝作用的白念珠菌群体感应分子法尼醇作为研究对象，利用线虫-白念珠菌感染模型观察5种化合物的体内抗真菌活性，并同时考察量效关系、化合物毒性，以及该模型用于抗真菌药物体内药效评价的可靠性。

1　材料和方法

1.1材料

菌株与线虫白念珠菌 (Candidaalbicans)SC5314由美国华盛顿乔治敦大学的William A.Fonzi教授惠赠，大肠杆菌 (Escherichiacoli)OP50、秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegansglp-4;sek-1)由美国哈佛大学的Eleftherios Mylonakis教授惠赠。

药物大扶康 (Fluconazole，FLC)购自辉瑞制药有限责任公司，两性霉素B (Amphotericin B，AmB)、5-氟胞嘧啶 (5-Fluorocytosine，5-FC)、法尼醇 (Farnesol，Far)均购自美国Sigma化学试剂公司，注射用醋酸卡泊芬净 (Caspofungin，Casp)购自美国默沙东公司。药物母液配置：氟康唑为注射剂，浓度2 mg/mL，直接取用。卡泊芬净使用无菌水溶解，其余药物使用二甲亚砜 (Dimethyl Sulphoxide，DMSO)溶解，配置成64 mg/mL储备液，分装后于-20℃贮存备用。

培养基LB培养基：LB 25 g，加三蒸水1 000 mL，高压灭菌后4℃保存备用。大肠杆菌OP50培养液：将大肠杆菌OP50接种至100 mL LB培养基中，于37℃，200 r/min振荡培养24 h浓缩备用。K2HPO4-KH2PO4缓冲液：KH2PO4108.3 g，K2HPO435.6 g，pH 6.0，定容至1 000 mL，滤过除菌，于4℃保存备用。NGM培养基：2.5 g蛋白胨，3 g氯化钠，18 g琼脂，972 mL三蒸水，高压灭菌，待温度降至60℃以下分别加入滤过除菌的K2HPO4-KH2PO4缓冲液25 mL，5 mg/mL胆固醇溶液1 mL，1 mol/L MgSO41 mL，1 mol/L CaCl21 mL，100 mg/mL链霉素1 mL。制备NGM培养板，待平板冷却凝固后，将100 μL浓缩的大肠杆菌OP50培养液涂布于培养基上，室温放置两天后备用。BHI培养基：BHI 37 g，琼脂20 g，加三蒸水至1 000 mL，高压灭菌，待温度降至60℃以下后，加入卡那霉素使其终浓度为45 μg/mL，于4℃保存备用。BHI培养液：BHI 37 g，加三蒸水至1 000 mL，高压灭菌后于4℃保存备用。M9缓冲液：KH2PO43 g，Na2HPO46 g，NaCl 2 g，MgSO4120 mg，加三蒸水至1 000 mL，高压灭菌后于4℃保存备用。沙堡葡萄糖琼脂固体培养基 (SDA)：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂17 g，加三蒸水900 mL，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，并以三蒸水定容至1 000 mL，高压灭菌后于4℃保存备用。YPD培养液：蛋白胨20 g，酵母浸膏10 g，葡萄糖200 g，加三蒸水定容至1 000 mL，高压灭菌后于4℃保存备用。

仪器HPX-300BS-Ⅲ型恒温培养箱 (上海新苗医疗器械制造有限公司)，C-W/0×B/22型体视显微镜 (Nikon SMZ745)，25℃低温培养箱 (Thermo Scientific)，CT15RE型离心机 (HITACHI)，HZ-2111K-B型恒温振荡器 (太仓市华利达实验设备有限公司)，Allegra®X-15R Centrifuge (Beckman Coulter)。

1.2方法

菌株培养从4℃保存的SDA固体培养基上挑取白念珠菌SC5314单克隆于YPD液体培养基，在30℃培养箱，200 r/min振荡培养，活化16 h。取200 μL活化后菌液涂布于BHI平板中央，30℃培养24 h后用于线虫感染。

线虫的饲养及同期化将线虫虫卵用5 mL M9缓冲液重悬，在室温环境下用垂直混合仪孵化过夜，得到L1期幼虫，将幼虫转移到NGM培养板上，每皿约含500条幼虫，25℃培养3 d后即得到同期化的成虫。

线虫-白念珠菌感染模型的建立将400～500条同期化的线虫成虫转移至长有白念珠菌的BHI平板的中央，25℃下孵育4 h，使线虫吞食并感染白念珠菌。之后，用M9缓冲液将感染后的线虫从BHI平板上洗下。将线虫分别转移至12孔板的不同孔中，每孔30条，孔内含2 mL液体培养基 (含80% M9，20% BHI，45 μg/mL卡那霉素)。25℃培养，连续观察6 d，记录线虫生存率与形态并拍照。

抗真菌化合物对感染后线虫的疗效观察在含有上述感染后线虫的孔内加入不同浓度的药物，空白感染对照组为加入等体积的溶剂，健康线虫对照组直接加入未感染白念珠菌的线虫。各药物浓度设置见表1。

1.3统计分析

使用GraphPad Prism 5软件对全部数据进行分析，Log-rank (Mantel-Cox) Test方法比较生存率差异，P<0.05差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1线虫-白念珠菌感染模型的成功建立

OP50为饲料培养的线虫作为健康线虫对照组，144 h后线虫全部存活，状态活泼 (见图1a)。白念珠菌感染组在感染后24 h大部分线虫咽喉部发生肿大，活动能力明显下降，部分线虫死亡且有少量菌丝生成穿出体表；48 h后死亡的线虫有大量菌丝穿出体表 (见图1b，黑色箭头所指为菌丝)，且生存率已低于50%，144 h后生存率约为23%，感染组与健康组相比P<0.000 1 (见图1c)。

2.2抗真菌药物在线虫-白念珠菌感染模型上的药效评价

本研究选取了4种临床具有代表性的抗真菌药物--唑类中的氟康唑，棘白菌素类中的卡泊芬净，两性霉素B和5-氟胞嘧啶，此外，选取已报道具有抗白念珠菌活性的群体感应分子法尼醇[5-7]用于药效评价。利用线虫-白念珠菌感染模型观察不同浓度的上述药物对感染后线虫的治疗效果，4个临床常用抗真菌药物都能不同程度地保护感染后线虫，线虫体表没有大量菌丝穿出的现象，存活的线虫状态活泼；法尼醇能够明显抑制白念珠菌菌丝形成，但对感染后线虫保护作用较弱，生存率没有明显提高。

表1各化合物处理后线虫的生存率与P值

Tab.1ThePvalue and survival rates ofC.elegansafter antifungal agents treatment (FLC.fluconazole,AmB.amphotericin B,5-FC.5-fluorocytosine,Far.farnesol,Casp.caspofungin)

化合物浓度(μg/mL)生存率(144h)P值FLC023%847%0.0186*1647%0.0065**3263%0.0004***6467%0.0003***AmB023%453%0.0146*860%0.0014**1650%0.0104**3247%0.0428*Casp023%250%0.0268*460%0.0033**860%0.0033**1673%<0.0001***5-FC023%233%0.4301447%0.0388*857%0.0056**1653%0.0121*Far030%450%0.1051852%0.05731633%0.51583240%0.5197

注：*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001

各化合物治疗组48 h时线虫显微照片见图2a～e，144 h的生存曲线见图3a～e，各化合物在不同浓度下线虫的生存率与P值见表1。8～64 μg/mL的氟康唑均显示出显著的保护作用，并具有较好的量效关系 (见图2a,3a)。8 μg/mL的氟康唑治疗组大部分线虫呈现活泼的健康状态，少量死亡的线虫出现咽喉部肿大或有少量菌丝形成 (图2a中黑色箭头所指为咽喉部)。4～32 μg/mL的两性霉素B在线虫模型上也表现出显著的保护作用，但高浓度时 (16、32 μg/mL)线虫生存率低于8 μg/mL浓度组，因毒性死亡的线虫增多 (见图2b,3b)。因毒性死亡的线虫呈全身黑色不透明的僵直状态，与因感染死亡时咽喉部肿大状态 (图2b黑色箭头所指)有明显区别。2～16 μg/mL卡泊芬净也显示出显著的保护作用，具有量效关系，16 μg/mL卡泊芬净没有表现出毒性，且死亡的线虫咽喉部未见肿大 (见图2c,3c)。5-氟胞嘧啶在≤4 μg/mL时没有显著的保护作用，在>4 μg/mL时表现出保护作用。16 μg/mL时能较明显的抑制线虫体内菌丝，感染死亡的线虫咽喉部有少量菌丝生成 (见图2d,3d)，抑制菌丝效果不如氟康唑、两性霉素B和卡泊芬净。法尼醇抗真菌活性较好，孔内环境较清澈，并能够抑制线虫体内白念珠菌菌丝，感染死亡的线虫咽喉部有少量菌丝生成，但线虫的生存率并未明显提高。≤8 μg/mL时线虫生存率与对照组相比没有统计学差异 (P>0.05)，≥16 μg/mL时线虫生存率反而下降，且出现较多呈僵直态死亡的线虫 (见图2e,3e)。

图1a.空白对照组健康线虫照片，b.白念珠菌感染组线虫照片，c.空白对照组和白念珠菌感染组线虫生存曲线图2a.8 μg/mL氟康唑治疗组的线虫照片，b.16 μg/mL两性霉素B治疗组的线虫照片，c.16 μg/mL卡泊芬净治疗组的线虫照片，d.16 μg/mL 5-氟胞嘧啶治疗组的线虫照片，e.16 μg/mL法尼醇治疗组的线虫照片图3a.氟康唑治疗组的生存曲线，b.两性霉素B治疗组的生存曲线，c.卡泊芬净治疗组的生存曲线，d.5-氟胞嘧啶治疗组的生存曲线，e.法尼醇治疗组的生存曲线 (所有线虫照片皆为48 h时所拍，线虫照片中左图标尺为1 000 μm，右图标尺为400 μm)

Fig.1a.Images of healthyC.elegansnematodes,b.Images of nematodes infected byC.albicans,c.Survival curves of healthy nematodes control group and andC.albicans-infected model groupFig.2a.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 8 μg/mL FLC,b.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL AmB,c.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL Casp,d.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL 5-FC,e.Images ofC.albicans-infected nematodes treated by 16 μg/mL FarFig.3a.Survival curves of FLC treated groups,b.Survival curves of AmB treated groups,c.Survival curves of Casp treated groups,d.Survival curves of 5-FC treated groups,e.Survival curves of Far treated groups (FLC.fluconazole,AmB.amphotericin B,5-FC.5-fluorocytosine,Far.farnesol,Casp.caspofungin) (all the images were taken after 48 h;bars in the nematodes images:1 000 μm-left ones,400 μm-right ones)

3　讨　　论

本研究评价了秀丽隐杆线虫-白念珠菌感染模型用于抗真菌药效评价的可靠性和稳定性，探究了临床常用抗真菌药物在线虫模型上的治疗窗，为之后研究时选取阳性药物及药物浓度提供依据。此外，本研究直接在显微镜下观察线虫存活与菌丝生长情况，与利用荧光蛋白令死亡线虫染色的观察方法[8]相比，更加直观地展现了利用线虫模型考察化合物抗真菌活性与毒性时的实验现象，并对因毒性死亡的线虫与因感染死亡的线虫加以区分，为之后筛选与研究抗真菌化合物提供了合理的评价依据。

线虫-白念珠菌感染模型的建立简便易行，感染组6 d后生存率仅为对照组的1/4，从形态上来看感染组线虫体内生成大量菌丝并穿出体表，与对照组存活线虫相比现象区别明显。在该模型上，氟康唑、两性霉素B、卡泊芬净和5-氟胞嘧啶的体内抗真菌活性得到了很好的验证，感染后线虫在治疗后菌丝显著被抑制，保护作用明显。两性霉素B在临床上使用时抗真菌活性虽好，但却具有较大毒性，这一点在线虫模型上也得以体现，高浓度两性霉素B的生存率低于低浓度组，线虫死亡状态呈全身黑色的僵直状态，与因感染死亡的线虫具有明显区别。法尼醇是白念珠菌生长到一定密度时自身分泌的一种群体感应分子，具有抑制白念珠菌生长[6]、诱导凋亡[5,7]、抗生物被膜[9]等活性，但有研究报道白念珠菌感染宿主后分泌法尼醇并提高自身致病力[10]，法尼醇在小鼠菌血症模型中也导致小鼠死亡率升高[10]。在本研究中，法尼醇可抑制线虫体内白念珠菌菌丝生长，但对线虫未表现出显著的保护作用，推测对线虫同样存在毒性，与前期体外实验和小鼠模型的研究报道结论一致。

综上所述，线虫-白念珠菌感染模型能够可靠、稳定地重现抗真菌药物在哺乳动物上的治疗效果，呈现出良好的量效关系，在观察药物对白念珠菌菌丝体内抑制作用的同时还能够体现药物的毒性。该线虫模型具有高通量、低成本、周期短等优点，目前在抗真菌药物研发方面的应用尚处于起步阶段，值得推广应用。

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[本文编辑]王飞

Evaluation of antifungal drugs using aCaenorhabditiselegans-Candidaalbicansinfection model

BI Shuang,HU Gan-Hai,HU Dan-dan,JIANG Yuan-ying,WANG Yan

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

ObjectiveTo investigate the reliability and stability ofCaenorhabditiselegans-Candidaalbicansinfection model in the application of antifungal drug evaluation,and to evaluate the value of this model in antifungal drug development.MethodC.albicanswas ingested byC.elegansand caused a persistent lethal infection to establish this infection model.Common antifungal drugs includingfuconazole,amphotericin B,caspofungin and 5-fluorocytosine,and farnesol,a quorum sensing molecule secreted byC.albicans,were used to treat the infected nematodes.The survival rate of the nematodes was observed to evaluate the activities of antifugal agents.ResultsC.albicansinfectedC.elegans,formed hyphae piercing the cuticle of the nematodes and resulted in the death of the nematodes.Fluconazole,caspofungin and 5-fluorocytosine inhibited the hyphal formation ofC.albicansin different degrees in thisinvivomodel,improving the survival ofC.elegansin a dose-dependent manner.Amphotericin B also showed antifungal effect in theC.elegans-C.albicansmodel,while at high concentrations as 16 or 32 μg/mL,the toxicity of amphotericin B was exhibited.Farnesol inhibited the hyphal formation ofC.albicans,but showed weak protection effect toC.elegans.ConclusionTheC.elegans-C.albicansinfection model is reliable for antifungal drug evaluation.Moreover,this model has high-throughput,low-cost,time-saving properties,and is worthy to be widely used in antifungal drug development.

Caenorhabditiselegans;Candidaalbicans;infection model;antifungal drug

2015-10-14

国家自然科学基金 (81273558,81072678)；上海市浦江人才计划 (14PJD001)

毕爽，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:shuangxun640@126.com;胡淦海，男 (汉族)，硕士.E-mail:349803307@qq.com;毕爽、胡淦海对本研究有同等贡献，为本文共同

。

王彦，E-mail:wangyansmmu@126.com

R 379.4

A

1673-3827(2016)11-0135-05