利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用

王玉连　张璐璐　秦玉璘　曹永兵　吴建华

(1.第二军医大学附属长海医院皮肤科，上海 200433；2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)



利福喷丁对氟康唑体外抗耐药白念珠菌的增效作用

王玉连1张璐璐2秦玉璘2曹永兵2吴建华1

(1.第二军医大学附属长海医院皮肤科，上海 200433；2.第二军医大学药学院新药研究中心，上海 200433)

目的测定利福喷丁 (Rifapentine)对氟康唑 (Fluconazole)体外抗耐药白念珠菌的增效作用。方法参考美国临床实验室标准化委员会 (CLSI)的M27-A2方案测定利福喷丁与氟康唑对白念珠菌的最低抑菌浓度 (MIC)；利用棋盘式微量液基稀释法测定利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效果。结果利福喷丁单药时对实验所用12株白念珠菌均无抗菌活性 (MIC80>1 024 μg/mL)。在氟康唑敏感白念珠菌株中，利福喷丁联合氟康唑后未表现出协同效应 (FICI>0.5)；在氟康唑耐药白念珠菌中，利福喷丁联合氟康唑后均表现出显著的协同作用 (FICI<0.1)。结论利福喷丁单用无抗白念珠菌活性，但利福喷丁能显著增强氟康唑抗耐氟康唑白念珠菌活性。

白念珠菌；利福喷丁；氟康唑；协同作用

[Chin J Mycol，2016，11(3):156-159]

白假丝酵母菌 (Candidaalbicans)亦称白念珠菌，是一种条件致病性真菌。近年来，由于广谱抗生素的大量、不合理应用，激素的滥用，肿瘤的化学治疗及器官移植后免疫抑制剂的应用，免疫功能低下患者不断增多，使真菌感染几率大大增加，其中白念珠菌感染最常见[1-2]。虽然氟康唑为临床首

选治疗白念珠菌药物，但随着氟康唑的大量、频繁使用，真菌耐药发生率逐年上升，导致临床治疗真菌感染的失败。

本课题组前期实验发现利福喷丁、舍曲林等联合氟康唑时对耐氟康唑白念珠菌可能有协同作用[3]。利福喷丁为利福霉素类抗生素，是结核病的一线用药，抗结核杆菌作用比利福平强，且药物不良反应比利福平小。目前为止，关于利福喷丁体外抗真菌协同作用的研究较少，因此，我们开展利福喷丁联合氟康唑体外抗白念珠菌的效应研究，为临床治疗白念珠菌感染探索有效用药。

1　材料和方法

1.1实验材料

仪器HZ-9211K恒温振荡器 (太仓市科教器材厂)；MJX智能型真菌培养箱 (宁波江南仪器厂)；SW-CJ-1F型单人双面超净化工作台 (苏州汉达工业自动化有限公司)；96孔平底带盖平板 (美国Corning Incorporated生产)；Multishan MK3型酶标仪 (芬兰Labsystems生产)。

菌株白念珠菌敏感菌株 (FLC-sensitiveCandidaalbicans)：SC5314，国际实验室通用菌株，由美国华盛顿乔治敦大学免疫微生物教研室William A.Fonzi教授惠赠 (氟康唑MIC80=0.5 μg/mL);Y0109，临床标准菌株，由第二军医大学药学院新药研究中心提供，并经形态学和生化学鉴定 (氟康唑MIC80=0.5 μg/mL)；药敏实验质控菌选用CLSI推荐的近平滑念珠菌 (Candidaparapsilosis)ATCC22019以及10株白念珠菌临床分离株，以上菌株均由第二军医大学药学院新药研究中心保存并提供，经形态学和生化学鉴定。所有菌株试验前均在沙氏培养基 (SDA)划板活化，30℃培养24～48 h，以保证受试真菌的活力与纯度，并于4℃保存备用。

药物利福喷丁 (美国melone公司，批号S0118A)，将利福喷丁用二甲基亚砜 (DMSO,Sigma公司)溶解为64 mg/mL，-20℃避光储存备用；氟康唑注射液 (大扶康DIFLUCAN，辉瑞制药有限公司，批号A075102，浓度2 mg/mL)，4℃储存。

培养基SDA培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，调整pH值为7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，高压灭菌，4℃保存。RPMI 1640培养液：RPMI 1640粉末10 g，NaHCO32.0 g，三氮吗啡啉丙磺酸钠 (MOPS，Sigma)34.5 g (0.165 M)，加三蒸水900 mL溶解，1 moL/L NaOH溶液调pH值为7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存。YEPD培养液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，定容至1 000 mL，高压灭菌，4℃保存备用。

1.2方法

参考2002年CLSI公布的的M27-A2方案[4]。

菌液制备用接种环从4℃保存的SDA培养基上挑取白念珠菌单克隆，接种到1 mL YEPD培养液，于30℃，200 r/min振荡培养，活化24 h使真菌处于指数生长期后期。取该菌液同样方法再次活化，16 h后用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×103～5×103CFU/mL。

药敏板制备和棋盘式微量稀释法取无菌96孔板，将配制好的菌液各100 μL加入96孔板的2～11列中，第11列不加药作生长对照，第12加入RPMI 1640培养液100 μL作空白对照，第1列加入相应体积的菌液及药液，1～10列逐级倍比稀释 (过程中3次更换枪头)，使敏感菌株氟康唑终浓度0.125～64 μg/mL；耐药菌株0.5～256 μg/mL；所有菌株利福喷丁浓度均为2～1 024 μg/mL。药物联合采用棋盘法，合用的2种药物在96孔板上以二维棋盘的纵 (A至H)横 (1至10)分别两个方向进行2倍比稀释，同时设立生长对照和空白对照。使得氟康唑与利福喷丁合用后，敏感株氟康唑的终浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 μg/mL；耐药菌株氟康唑终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL；所有菌株利福喷丁终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL。

评估标准最低抑菌浓度 (MIC值)和分数抑菌浓度指数。MIC80值 (即真菌生长80%被抑制时的最低药物浓度)：在35℃恒温培养箱中培养24 h及48 h后用酶标仪于630 nm下测各孔OD值，并与阳性对照孔相比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为氟康唑及利福喷丁对该受试菌株的MIC80值，每次实验配制一块质控菌药敏板，质控菌MIC值在规定的参考范围内，所有药敏试验均重复操作3次。分数抑菌浓度指数 (fractional inhibitory concentration index，FICI)：联合用药时各药物MIC值分别除以单独用药时MIC值的商的和，即FICI=MIC (A combo/MIC (A alone)+MIC (B combo/MIC (B alone)，是评价联合用药时两药间相互作用的主要参数。FICI判定标准：FICI<0.5为协同作用，FICI值越小，两药协同作用越强；0.54为拮抗作用。

2　结　　果

利福喷丁与氟康唑对不同来源不同敏感性的白念珠菌的作用结果见表1。单用利福喷丁对所有受试菌株的MIC80测定值均>1 024 μg/mL；对氟康唑敏感白念珠菌 (氟康唑MIC80<8 μg/mL)SC5314、Y0109、163，氟康唑单用药时的MIC80值为0.5～1 μg/mL，与利福喷丁联合后其MIC80值没有变化，利福喷丁与氟康唑合用的FIC指数为1.000 (FICI>0.5)，两药的相互作用表现为无关作用；对氟康唑耐药白念珠菌 (氟康唑MIC80>32 μg/mL)112869、112679、100、103、331、632、J18、J38及18#，两药联合后氟康唑的MIC80值由单用时的>64 μg/mL，下降至1～8 μg/mL，利福喷丁的MIC80值由单用时的>1 024 μg/mL，下降至32～64 μg/mL，FIC指数分别为0.039、0.023、0.020、0.047、0.035、0.039、0.039、0.047、0.035 (FICI<0.5)，两药的相互作用为协同作用。

表1利福喷丁和氟康唑体外抗白念珠菌效应

Tab.1Invitroantifungal susceptibility assays of rifapentine with fluconazole againstCandidaalbicans

编号菌株单药MIC80(μg/mL)联合MIC80(μg/mL)FCZRFTFCZRFTFICI联合效应1SC53140.5>10240.511.000无关2Y01091>1024111.000无关31630.5>10240.511.000无关4112869>64>10241640.039协同5112679>64>10241320.023协同6100>256>10242320.020协同7103>256>10248640.047协同8331>256>10242640.035协同9632>256>10244640.039协同10J18>256>10244640.039协同11J38>256>10248640.047协同1218#>256>10242640.035协同

注：MIC.minimal inhibitory concentrations，最低抑菌浓度；FICI.fractional inhibitory concentration index，分数抑菌浓度指数；FCZ.fluconazole，氟康唑；RFT.rifapentine，利福喷丁

3　讨　　论

利福喷丁为利福霉素类抗结核药，其抗结核机制与利福平基本相似，可与依赖DNA的RNA多聚酶的亚单位牢固结合，抑制细菌RNA的合成，防止该酶与RNA连接，阻断RNA转录过程，进而使DNA和蛋白的合成停止。同一剂量下利福喷丁对结核杆菌的杀灭作用明显强于利福平,且同等剂量下对患者胃肠道刺激及肝功能损伤均小于利福平，为抗结核的一线用药[5-6]。20世纪70年代初，研究者开始探索利福霉素类抗生素联合抗真菌药的协同效应。Beggs等[7]通过棋盘微量稀释法证明了利福平对两性霉素B抗临床分离的白念珠菌、近平滑念珠菌、星状念珠菌等40株假丝酵母菌生长的增效作用。念珠菌生物被膜的形成与其耐药性有重要的关系，Del Pozo等[8]通过不同药物单用或合用对白念珠菌生物被膜形成研究表明：两性霉素B单药时最小生物膜清除浓度>10 mg/mL,与利福平联合用药时最小生物膜清除浓度为0.04 mg/mL,即利福平与两性霉素B体外抗白念珠菌生物膜的形成具有协同作用。研究还显示利福平对两性霉素B体外抗光滑念珠菌等其他念珠菌属生物被膜的形成也有增效作用。

氟康唑为三唑类抗真菌药，主要通过抑制真菌细胞膜的合成发挥其抑菌作用。目前由于氟康唑的临床长期、反复、不合理应用，致病真菌的耐药率日趋升高，其中以白念珠菌耐药情况最严峻[9]。目前文献报道真菌耐药机制主要包括四部分：①外排泵基因的过度表达：药物外排增多导致白念珠菌胞内药物浓度减低，这是对唑类药物耐药的重要机制之一，相关外排基因主要包括ATP结合盒转运家族 (ATP-binding cassette transporter)和异化扩散载体超家族 (major facilitators)。在白念珠菌的ATP结合盒转运家族中，CDR1、CDR2基因的高表达与唑类耐药密切相关，异化扩散载体超家族的耐药相关基因主要为MDR1p和Fullp[10]。②药物靶酶的改变：唑类抗真菌药作用靶酶是Erg11，Erg11基因的突变或过度表达是引起耐药的重要原因之一[11]。③生物膜的形成：生物被膜形成后，白念珠菌对氟康唑的敏感性下降了几十倍甚至几百倍，目前其耐药机制尚不明确，可能与生物屏障的形成有关。④念珠菌细胞膜通透性改变：细胞膜通透性降低导致胞内抗真菌药物累积减少，不足以发挥其抗真菌作用。目前，多采用增加药物剂量、开发新药等方法克服白念珠菌耐药问题。加大药物剂量必定会增加其毒副作用，新药的开发耗费时间长、成本高、成效低。近年来，人们在探索科学的联合用药同时，开始开发抗真菌药增效剂。最近研究表明黄酮类化合物与氟康唑联用能显著增强其抗真菌活性，da Silva等[12]发现黄酮类化合物可能通过增加活性氧 (ROS)、破坏线粒体、损伤DNA诱导细胞凋亡发挥对氟康唑的增效作用。大量研究表明黄芩素对氟康唑具有显著协同抗真菌作用，Huang S等[13]研究发现黄芩素可能通过抑制药物外排泵对氟康唑起增效作用。大量文献报道他克莫司等钙调神经酶抑制剂、阿司匹林等非甾体抗炎药、多虑平等三环类抗抑郁药、三氯生等抗生素以及小檗碱等植物提取物对氟康唑抗耐药真菌有增效作用。

本研究参照参考CLSI提出的M27-A2方案，对12株白念珠菌进行药敏试验，观察利福喷丁和氟康唑体外抗白念珠菌联合效应。在实验所用的12株白念珠菌中，利福喷丁单用药时MIC80值均>1 024 μg/mL，未表现出抗真菌活性；对氟康唑敏感白念珠菌株，利福喷丁与氟康唑的MIC80值在合用前后没有变化，两药合用的FICI>0.5，表明利福喷丁与氟康唑联合未表现出协同效应；对氟康唑耐药白念珠菌株，利福喷丁与氟康唑合用后，氟康唑的MIC80值降低了32～128倍，利福喷丁的MIC80值降低了16～32倍，FIC指数为0.020～0.047 (FICI<0.1)，两药合用表现出显著的协同作用。利福喷丁协同氟康唑体外抗白念珠菌作用机制尚不明确，本次研究表明利福喷丁单用无抗真菌活性，其对氟康唑的增效作用只表现在氟康唑耐药白念珠菌菌株中，而在敏感菌株中未表现出对氟康唑的增效作用，可能是氟康唑在较低浓度时就可以抑制敏感菌株的生长，无需联合其他药物。

本课题组首次发现利福喷丁对氟康唑抗氟康唑耐药白念珠菌具有增效作用，我们将在后续研究中通过观察细胞超微结构、细胞周期，检测胞膜甾醇含量、胞内药物含量及相关基因表达等实验进一步探索利福喷丁对氟康唑抗耐药白念珠菌作用机制，为耐药白念珠菌感染的临床治疗及新药研发等提供新途径。

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[本文编辑]施慧

Synergistic effect of rifapentine with fluconazole against FLC-resistanceCandidaalbicans

WANG Yu-lian1，ZHANG Lu-lu2,QIN Yu-lin2,CAO Yong-bing2，WU Jian-hua1

(1.Desect1mentofDermatology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity，Shanghai200433,China;2.NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacology,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai,200433,China)

ObjectiveTo explore theinvitrosynergistic effect of rifapentine with fluconazole on FLC-resistanceCandidaalbicans.MethodsThe minimal inhibitory concentrations (MIC) of rifapentine and fluconazole againstCandidaalbicanswere detected by method of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A2 microdilution.The effects of rifapentine and fluconazole againstCandidaalbicansinvitrowere valued by broth microdilution checkerboard technique system.ResultsIn the antifungal susceptibility assay，there was no antimicrobial activity of rifapentine single used against the 12 strains ofCandidaalbicans(MIC>1 024 μg/mL).The combined of rifapentine and fluconazole didn't display synergistic effect on the FLC-sensitiveCandidaalbicans(FICI>0.5),however,it had a significant synergistic effect on the FLC-resistanceCandidaalbicans(FICI<0.1).ConclusionRifapentine alone demonstrated no antifungal activity,but rifapentine can significantly enhance the effect of fluconazole against FLC-resistanceCandidaalbicans.

Canidiaalbicans；rifapentine；fluconazole；synergism

2015-10-16

国家973项目子课题 (2013CB531602)

王玉连，女 (汉族)，硕士研究生在读，住院医师.E-mail:weilaiyisheng626@163.com

曹永兵，E-mail:ybcao@vip.sina.com；吴建华，E-mail:wujh_ch@163.com

R 978.5

A

1673-3827(2016)11-0156-04