流感H10亚型重配病毒在不同细胞生长能力的比较

刘丽琦　周剑芳　鲁健　李梓　曾晓旭　赵翔　王大燕　舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，世界卫生组织流感参比与研究合作中心



流感H10亚型重配病毒在不同细胞生长能力的比较

刘丽琦周剑芳鲁健李梓曾晓旭赵翔王大燕舒跃龙

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，世界卫生组织流感参比与研究合作中心

【摘要】目的评估两株流感H10亚型重配病毒在不同细胞内的生长特性，筛选可用于疫苗生产的细胞。 方法基于A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)病毒的表面基因，利用反向遗传技术构建以高产PR8病毒为骨架的RG-H10N8(6+2)和RG-H10N1(7+1)两种重配病毒，在SPF鸡胚增殖病毒后，经序列测定确认，以质粒拯救RG-PR8病毒为对照，比较病毒在MDCK和Vero细胞上的生长敏感性；以相同MOI感染MDCK细胞后，比较病毒的生长特性。结果两种流感H10重配病毒和RG-PR8病毒在MDCK细胞上均能检测到病毒滴度，但是在Vero细胞上，RG-H10N8检测不到病毒滴度，RG-H10N1和RG-PR8可以检测到病毒滴度；用相同的MOI感染MDCK细胞后，RG-PR8生长能力强于两种重配病毒，两种重配病毒间差异不大。结论两种流感H10重配病毒在MDCK细胞上生长能力较好，MDCK较Vero细胞对H10重配病毒更敏感，来源不同的NA会影响病毒在Vero细胞上的生长敏感性。

【主题词】流感病毒；H10亚型；重配；生长特性

Fund program: National Science and Technology Major Project-Study on the cross species mechanism of new subtype influenza virus H7N9 (2014ZX10004002-001-003)

流感病毒在人群可造成季节性流感或流感大流行，接种疫苗是预防流感最有效的途径。由于流感病毒容易变异，因此世界卫生组织每年组织疫苗推荐会，以确定新的季节性流感疫苗株，同时筛选可能会造成流感大流行的动物源性流感病毒疫苗株。为了快速获得有效高产的疫苗株，需要构建含有表面蛋白HA和NA，内部基因来源于经实验室长期筛选的在鸡胚中高产并减毒的A/ PR/ 8/ 34 (H1N1) (简称PR8) 毒株，即6+2 重配策略，或仅替换表面HA基因，其余基因均使用PR8，即7+1重配。构建重配病毒的方法包括经典重配和反向遗传技术，后者能够快速获得重配疫苗株。2013年我国首次发现人感染H10N8禽流感病例[1]，并在同一地区又接连发生两例病例，在随后的流行病学调查中发现，该病毒来源于活禽市场[2]，因此快速获得H10N8流感疫苗株是防控的重要手段。

本研究利用反向遗传技术，构建了两种不同基因构成的H10亚型重配病毒，两种病毒分别感染MDCK和Vero细胞，比较病毒在两种细胞上的生长敏感性，以及在敏感细胞上的生长特性，筛选出更适于病毒生长的细胞系，为未来生产细胞基质疫苗奠定基础。

1材料与方法

1.1细胞和病毒MDCK和Vero细胞由国家流感中心保存，野生型病毒A/Jiangxi-donghu/346/2013(H10N8)(简称JX346)分离自首例人感染H10N8病例，由国家流感中心分离并保存。

1.2重配病毒的构建利用国家流感中心反向遗传技术平台系统中的A/PR/8/34(简称PR8)骨架质粒系统，按照之前发表的拯救方法[3]构建重配病毒；同时制备重配的PR8病毒作为对照病毒；以上病毒均经SPF鸡胚传代扩增一次用于本实验。

1.3序列测定与分析为确认两株H10重配病毒HA和NA基因来源，将病毒按照国家流感中心标准操作规程，使用德国Qiagen公司的RNeasy Mini Kit (74106)提取核酸RNA，使用科室引物库中两端带有M13序列的正反向引物，用德国Qiagen公司one-step RT-PCR kit(210212)扩增HA和NA基因，扩增后基因经Affymetrix公司的USB PCR产物纯化酶纯化后，使用3730xl测序仪测序，使用Lasergene(Version 7.1.0) 软件拼接，使用BioEdit(Version 7.1.3.0)分析序列。

1.4病毒滴度测定

1.4.1细胞组织中病毒滴度测定：于96孔板中制备单层细胞，每孔100 μl PBS洗两次，将病毒稀释液以每孔100 μl接种于细胞上，每稀释度4个复孔，置37℃的5%C02培养箱吸附1 h，弃病毒感染液，PBS洗两次；每孔加100 μl病毒维持液，继续培养72 h，观察CPE并取上清作HA血凝实验。

1.4.2鸡胚组织中病毒滴度测定：将病毒做稀释，以每稀释度100 μl l接种4枚鸡胚，35℃培养48h后收尿囊液作HA血凝实验；HA血凝实验用1%豚鼠红细胞测定，结果按Reed—Muench方法计算TCID50和EID50。

1.5生长曲线测定将病毒分别以MOI=0.1，0.01和0.001感染细胞，在感染后24 h、48 h和72 h分别收取感染细胞上清后，放置-80℃保存，所有样本统一解冻后用1%豚鼠红细胞测定HA血凝滴度，根据HA结果绘制生长曲线。

2结果

2.1重配病毒鉴定利用反向遗传技术，构建了包含JX346基因和A/PR/8/34病毒基因的2株重配病毒，一株重配病毒的表面基因HA和NA来自JX346，内部基因来自PR8，命名为RG-H10N8；另外一株重配病毒的表面基因HA来自JX346，NA和内部基因来自PR8，命名为RG-H10N1。

两种重配病毒经序列测定显示，其HA基因与原始母本病毒比较氨基酸序列没有差异，表明HA基因是来自母本病毒的H10亚型；NA基因经序列测定显示分别是NA1和NA8亚型，内部基因来自PR8病毒，与预期相符，具体基因来源见图1。

2.2在不同培养介质上的病毒滴度测定为了检测两株病毒在不同培养介质上的敏感性，将病毒分别感染Vero、MDCK和SPF鸡胚，同时以RG-PR8病毒做对照，结果显示在鸡胚和MDCK上，三株病毒均能检测到病毒滴度，在MDCK细胞上的滴度从低至高分别相差约10倍，依次是RG-H10N8

图1　重配病毒基因来源示意图Fig.1　Gene source sketch map of reassortant viruses

滴度Titer病毒VirusesRG-H10N8RG-H10N1PR8log10EID50/ml7.427.639.17log10TCID50/ml(V)/4.252.37log10TCID50/ml(M)5.876.787.73

注：“V” Vero 细胞；M：MDCK细胞；“/”：未检测到病毒滴度；表中结果均是两次检测结果均值

Note： “V” Vero cell；M：MDCK Vero cell；“/”virus was not detected; Results in the table is the mean of the twice test

2.3病毒生长曲线上述病毒滴度测定结果显示MDCK细胞较Vero细胞对病毒更敏感，为了进一步了解病毒在MDCK细胞上的生长情况，将病毒分别以不同的MOI感染MDCK细胞，从图2中的结果可见三株病毒在不同的MOI感染后均呈现HA滴度随时间增加的趋势；在MOI=0.1和MOI=0.01感染时，在24 h时三株病毒HA滴度相差不大，虽然所有病毒感染48 h后滴度均明显上升，72 h后滴度继续上升，同时镜下观察细胞CPE较48 h明显，但是两株H10重配病毒的HA滴度在48 h和72 h时均明显低于RG-PR8病毒，重配病毒之间差异不大；在MOI=0.001时，三株病毒HA滴度均较低，病毒之间HA滴度差异不大。

图2　病毒以不同MOI感染MDCK细胞的生长曲线Fig.2　Growth curve at different MOI in MDCK cells

3讨论

近年来，禽流感病毒感染人的病例时有发生，感染人类的病毒型别也不仅限于H5N1、H7N9和H9N2亚型[4，5，6]，2013年首次报道人感染H10N8病例后，2014年又有2例感染病例报道，因此构建H10亚型流感病毒疫苗株，并选择合适的培养介质是疫情防控的重要技术储备；WHO推荐采用传代细胞作为培养基质，利用反向遗传技术构建重配病毒作为流感大流行相关禽流感病毒储备疫苗株，即构建含有HA和NA或仅含有HA基因，其余基因来自高产的PR8的重配病毒。重配病毒可以感染细胞或鸡胚制备疫苗，但鸡胚作为疫苗生产的基质，可能引入外源性病毒污染，同时制备的疫苗产品均质性差，因此选用合适的细胞生产疫苗是流感疫苗的发展趋势，可使疫苗的抗原性更接近流行株；但不同的毒株对细胞的易感性不同，因此本研究就构建的两株H10重配病毒对MDCK和Vero细胞的易感性进行了研究，为未来研究细胞基质疫苗奠定基础。

本研究病毒感染细胞实验结果表明，在感染MDCK细胞的实验中，两株H10重配病毒均易感，在MOI=0.1和MOI=0.01感染时，病毒能达到较高的滴度但是低于PR8病毒。已有文献报道Vero细胞在流感病毒疫苗生产中的应用[7]，但本研究结果显示在Vero细胞上RG-H10N8检测不到病毒滴度，可以检测到RG-H10N1的滴度，序列分析显示两株H10重配病毒的HA基因完全相同，仅NA基因不同，说明NA的不同会影响毒株对细胞的感染能力；但RG-H10N1检测到病毒滴度也明显低于在MDCK细胞中的培养滴度，说明Vero细胞对H10重配病毒病毒不如MDCK细胞敏感，这与之前的文献结论是一致的：即使是生长能力良好的PR8病毒在Vero细胞上也需要适应性传代以获得高滴度产物[8]。

MDCK细胞是流感病毒分离培养的常用细胞，近年来用该细胞生产流感疫苗也获得了较好的效果[9,10]，本研究的结果表明MDCK细胞较Vero细胞对流感H10亚型重配病毒更敏感，可进一步用于H10重配病毒细胞疫苗的培养基质研究。

4参考文献

[1]Chen H，Yuan H，Gao R，et al. Clinical and epidemiological characteristics of a fatal case of avian influenza A H10N8 virus infection：a descriptive study . Lancet，2014，383：714-721.doi: 10.1016/S0140-6736(14)60111-2.

[2]傅伟杰,胡茂红,刘晓青,等.江西省3 例H10N8 禽流感病毒感染者回顾性分析, 中华流行病学杂志,2014 , 35：1131-1134. doi：10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2014.10.012.

[3]刘丽琦，董婕，薄洪，等，H9N2禽流感病毒反向遗传系统的构建和鉴定，中华实验和临床病毒学杂志，2009，23：41-43.doi: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2009.01.015.

[4]Shu Y, Li CK, Xu XN, et al. Avian influenza A(H5N1) viruses can directly infect and replicate in human gut tissues . J Infect Dis, 2010, 201:1173-1177.doi: 10.1086/651457.

[5]Gao R, Cao B, Hu Y, et al. Human infection with a novel avian-origin influenza A (H7N9) virus . N Engl J Med, 2013, 368:1888-1897. doi: 10.1056/NEJMoa1304459.

[6]Butt KM, Smith GJ, Chen H, et al. Human Infection with an Avian H9N2 Influenza A Virus in Hong Kong in 2003 . J Clin Microbiol, 2005,43：5760-5767. doi:10.1128/JCM.43.11.5760-5767.

[7]Montomoli E，Khadang B，Piccirella S，et al．Cell culture derived influenza vaccines from Vero cells：a new horizon for vaccine production ．Expert Rev Vaccines，2012，11：587-594．doi: 10.1586/erv.12.24.

[8]Hu W, Zhang H, Han Q, et al. A Vero-cell-adapted vaccine donor strain of influenza A virus generated by serialpassages . Vaccine ,2015,33:374-381. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.11.007.

[9]Haredy AM，Takenaka N，Yamada H，et al．An MDCK cell culture-derived formalin-inactivated influenza virus whole-virion vaccine from an influenza virus library confers cross-protective immunity by intranasal administration in mice ．Clin Vaccine ImmunoI，2013，20：998-1007．doi: 10.1128/CVI.00024-13.

[10]Doroshenko A，Halperin SA.Trivalent MDCK cell culture derived influenza vaccine Optaflu(Novartis Vaccines) ．Expert Rev Vaccines，2009，8：679-688．doi: 10.1586/erv.09.31.

通信作者：舒跃龙，Email：yshu@cnic.org.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.01.020

基金项目：国家科技重大专项—H7N9等新型流感病毒跨种传播机制研究(2014ZX10004002-001-003)

(收稿日期：2015-10-20)

Comparison of the growth characteristics of influenza subtype H10 reassortant viruses in different cells

LiuLiqi,ZhouJianfang,LuJian,LiZi,ZengXiaoxu,ZhaoXiang,WangDayan,ShuYuelong

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChinaCDC,WHOCollaboratingCenterforReferenceandResearchonInfluenza,Beijing102206,ChinaCorrespondingauthor:ShuYuelong，Email：yshu@cnic.org.cn

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the cells for producing vaccine of avian influenza H10 subtype, the growth characteristics of influenza H10 subtype reassortant viruses in different cells (MDCK and Vero) were investigated. MethodsReassortant viruses, RG-H10N1(7+1) and RG-H10N8(6+2), between wild-type virus A/Jiangxi-donghu/346/2013(JXH10N8) and high-yielding virus A/ Puerto Rico/ 8/ 34(PR8) were constructed with reverse genetic system. Viruses were propagated in SPF embryonated chicken eggs. The growth characteristics of the two reassortant viruses were compared after inoculating MDCK and Vero cells respectively, with RG-PR8 as the control. Viral growth characteristics were studied at different MOI in MDCK cells. ResultsAll viruses could be detected TCID50in MDCK cells. RG-PR8 and RG-H10N1could be detected TCID50in Vero cells but not RG-H10N8. There were no significant difference in HA titer between the two reassortant viruses at the same MOI, but both reassortant viruses exhibited lower HA titers than that of PR8 in MDCK cells. ConclusionBoth influenza H10 subtype reassortant viruses grew better in MDCK cells. MDCK cells are more sensitive to the influenza H10 reassortant viruses, and NA from different subtypes could affect the grow capability of reassortant viruses in Vero cells.

【Key words】Influenza virus; H10 subtype; Reassortant virus; Growth characteristics