云南库蠓中版纳病毒的首次分离及鉴定

寇美玲　朱建波　杨恒　肖雷　王金萍　苗海生　王静林　李华春

650224 昆明，云南省畜牧兽医科学院重点实验室



·论著·

云南库蠓中版纳病毒的首次分离及鉴定

寇美玲朱建波杨恒肖雷王金萍苗海生王静林李华春

650224 昆明，云南省畜牧兽医科学院重点实验室

【摘要】目的了解云南库蠓携带病毒及感染情况。方法2011年9月-11月在云南曲靖市采集库蠓、牛血清及猪血清标本；库蠓上清液接种于C6/36细胞进行病毒分离；对可疑分离物进行分子生物学鉴定；采用微量中和试验检测牛、猪血清病毒抗体。结果捕获到的18 160只库蠓中，短跗库蠓8 300只(45.7%)，琉球库蠓7 100只(39.1%)。分离到2株阳性分离物，命名为SC093和SC233。经鉴定，其VP2、VP4、VP8序列与版纳病毒中国株(AF134526)核苷酸序列同源性为99.0%，属于版纳病毒；1份牛血清与SC093和SC233病毒株中和抗体滴度分别为160和40,阳性率为0.5%(1/200)；10份猪血清与SC093和SC233病毒中和滴度分别为80-320和20-80,阳性率为1.7%(10/535)。结论所分离的SC093和SC233病毒株经鉴定为版纳病毒，并能引起猪和牛的感染，这是首次从库蠓中分离到版纳病毒。

【主题词】库蠓；版纳病毒；分离；鉴定

Fund programs: Important cattle and sheep arbovirus disease prevention and control key technology research and application(201303035); Applied basic research projects of the youth science fund in Yunnan province(2015FD064)

云南省曲靖市师宗县气候温和，立体气候明显，年平均相对湿度在80%左右，适合各类吸血节肢动物生存繁殖，利于蠓媒病毒的存在和传播。1979年，我国首次在云南省师宗县分离到蓝舌病病毒[1]。近年来，一些蠓媒病毒在世界各地动物中引起严重的传染病，甚至导致大量动物的死亡以及巨大的经济损失，成为日益严重的世界公共卫生问题。为了进一步了解师宗县库蠓种类、携带病毒和当地动物感染情况，我们于2011年9月-11月在师宗县监控牛场采集库蠓标本、牛血清标本,以及在麒麟区及陆良县采集猪血清标本，进行蠓传虫媒病毒分类鉴定及其动物感染调查，结果如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1鸡胚、细胞及培养基:10日龄鸡胚购至小哨鸡场；金黄地鼠肾细胞(BHK-21)、白纹伊蚊卵细胞(C6/36)为本实验室保存；细胞用培养基M199、MEM 为云南省畜牧兽医科学院重点实验室自行配制。1.1.2试剂及仪器:混合酶-DNase购自Ambion公司，Benzonase购自Novagen公司，RNase购自美国Promega公司；核酸提取试剂盒Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0及Klenow Fragment试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；cDNA合成试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit购自日本TaKaRa公司；SuperScript II购自美国Invitrogen公司；pGem T-easyX载体购自Invitrogen公司；引物K-8N(GACCATCTAGCGACCTCCACNNNNN)及引物K(GACCATCTAGCGACCTCCAC)由上海生物工程公司合成；PCR仪为Eppendorf公司产品；310DNA测序仪为美国ABI公司产品。

1.2标本采集

1.2.1库蠓标本采集:2011年9月—11月，夜间23：00-06：00，共采集库蠓标本12次。在云南省曲靖市师宗县蓝舌病监控牛场用改装的捕蚊器捕捉库蠓，次日清晨把蚊笼放入-20℃冰箱20 min，根据库蠓形态学特征[2]在显微镜下进行分类鉴定，40～50只/组放入冻存管中，编号登记，迅速冻存于液氮罐中。1.2.2动物血清标本采集:2011年8月—11月，在云南省曲靖市师宗县蓝舌病监控牛场采集牛全血，在曲靖麒麟区及陆良县猪场采集猪全血，取血后37℃让血液凝固 1 到 2 h(不加抗凝剂)；4℃ 冰箱过夜；当血清自然析出后，4℃离心3 000 r/min 10 min，将血清移至另一干净试管，分装成小份，编号储藏在-80℃。

1.3蠓标本处理、病毒分离和鉴定

1.3.1库蠓标本处理和病毒分离:从液氮罐中取出库蠓冻存管，将库蠓标本对应编号放入洁净1.5 ml离心管中，用无血清液Eagle(含1%双抗、1%谷氨酰胺) 清洗库蠓标本2次，1 500 r/min离心10 min，弃上清。置库蠓于研钵，加入2 ml M199细胞维持液研磨成匀浆，4℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液100 μl接种至长成70%～80%单层的C6/36细胞试管，25℃吸附1 h后弃去细胞管内液体，加入2 ml含2%小牛血清的细胞维持液，设置2支正常细胞对照管，共同置于25℃培养箱中培养，每天观察CPE变化情况。舍弃连续盲传三代后仍不出现CPE的细胞管，出现CPE的细胞管连续传代使之出现规律病变，再传一代扩增病毒分装-85℃保存备用。

1.3.2病毒鉴定

1.3.2.1病毒液的处理及核酸的提取:向出现规律CPE后的1代细胞上清中加入混合酶，处理外源核酸[3]。按核酸提取试剂盒说明书提取病毒总核酸。

1.3.2.2cDNA合成及RT-PCR 利用cDNA合成试剂盒，引物K-8N[4]等合成cDNA第一链。取5 μl模板，采用引物 K进行PCR扩增，扩增体系为50 μl，依次加入下列试剂，使最终浓度达到5 mmol/L MgCl2、 0.2 mmol/L dNRPs、1×PCR Gold buffer、 0.8 mmol/L primer K、0.8 μmol/L引物 K及0.94U AmpliTaq Gold，充分混匀。95℃预变性5 min;95℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，33个循环;72℃ 7 min。1%琼脂糖电泳检查扩增条带。回收大于500 bp片段PCR产物，克隆入载体,本实验室测序仪进行测序，将序列进行Blast比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，MEGA 3.1 软件采用Neighbour-joining (NJ) 方法的进化树绘制，Bootstrap值为1 000。

1.4鸡胚感染实验取0.1 ml出现规律CPE后1代细胞上清，静脉接种鸡胚，逐日观察，48 h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，48 h后死亡鸡胚按第1天算起，登记死亡天数，并将死胚放于4℃冰箱内保存，待收胚全部完毕，剪破壳膜、尿囊膜、羊膜，取出胚体观察记录。

A：C6/36细胞对照(C6/36 Cell Control)B：接种SC093的C6/36细胞(SC093 4d Post-Infection)C：SC233感染后的C6/36细胞(SC233 4d Post-Infection)图1　云南省师宗县库蠓分离物SC093和SC233对C6/36 细胞的致病变作用Fig.1　CPE caused by Culicoides isolates from Shizong County of Yunnan province on C6/36 cells

1.5微量中和试验血清中抽出535份猪血清、200份牛血清，按Karber方法计算出TCID50/50 μl[5], 参照国标《蓝舌病微量血清中和试验及病毒分离和鉴定方法》(GB/T180089-2000)方法进行[6]。

2结果

2.1标本采集2011年9月-11月云南省曲靖市师宗县蓝舌病监控牛场共采集到库蠓18 160只，经形态学分类鉴定，短跗库蠓有8 300只，琉球库蠓有7 100只，分别占采集库蠓标本总数的45.7%和39.1%，提示这两种库蠓为该地优势蠓种，还有少数东方库蠓、连斑库蠓、荒川库蠓等。

2.2病毒分离采集到的所有蠓标本分454批处理，离心上清接种C6/36细胞进行病毒分离，获得2株可疑分离物SC093和SC233，这两株可疑分离物在C6/36细胞上产生规律细胞病变，病变时间分别是4～5 d、2～3 d，细胞病变特点主要表现为聚集、破碎、脱落(图1)；在BHK-21细胞上不产生细胞病变。

2.3病毒分子生物学鉴定采用随机RT-PCR对两株可疑分离物进行扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳出现弥散条带。切胶纯化大于500 bp片段的PCR产物，克隆入pGem T-easyX载体，转化感受态细胞后随机选取SC093、SC233各6个克隆进行测序，对获得序列进行Blast比对，发现SC233株病毒6个克隆中有5个[VP2基因3个(719 nt，754 nt,693 nt)、VP8(457 nt)和VP4(625 nt)基因各1个]，SC093株病毒有1个[VP2基因(745 nt)]克隆序列与版纳病毒核苷酸序列的同源性在81%(EU265684)-99%(AF134528)之间。进一步对SC093和SC233两株新病毒VP2基因部分序列(2301-2900)进行分析，结果显示两株新分离病毒核苷酸同源性为100%；新分离的2 株病毒与东南亚双链RNA病毒属病毒绘制基因遗传进化树显示：2 株新分离病毒与8株版纳病毒处于同一个进化分支，提示云南师宗县2株可疑分离物SC093和SC233为版纳病毒(见图2)。

图2　云南省师宗县新分离病毒株SC093和SC233 VP2基因(2 301-2 900)600 nt核苷酸序列系统进化树Fig.2　Phylogenetic tree based on 600 nt of the VP2 (2 301-2 900) of SC093 and SC233 viruses isolated from Shizong County of Yunnan Province, China Abbreviations are as follows: BAV: Banna virus；KDV: Kappdio virus; LNV: Liaoning virus.

2.4病毒对鸡胚的感染性将SC093和SC233两株病毒分别接种10日龄鸡胚7枚，两毒株分别在接种鸡胚后计算天数的第4天、第6天收胚。收胚后观察到：鸡胚全身性出血(图3)，提示两株新分离版纳病毒对鸡胚有致病性。

A：SC233毒株接种鸡胚4天后出血情况; B：SC093毒株接种鸡胚6天后出血情况； C：对照组接种M199 9天后A: 4 days after inoculated with SC233 virus；B: 6 days after inoculated with SC093 virus；C: 6 days after inoculated with M199图3　云南师宗县两株新分离版纳病毒SC093和SC233感染鸡胚结果Fig.3　Hemorrhages of chicken embryo inoculated with Banna virus

2.3动物血清检测结果在曲靖市麒麟区、陆良等牛场和猪场共采集到牛血清200份、猪血清535份，对这些血清样本进行微量中和实验检测新分离版纳病毒中和抗体，结果显示牛血清版纳病毒抗体阳性1份，阳性率为0.5%；曲靖市麒麟区猪场采集猪血清版纳病毒抗体阳性8份，陆良县猪场采集猪血清版纳病毒抗体阳性2份，两地猪场猪血清阳性率为1.7%；检测阳性牛血清标本抗SC093和SC233病毒中和抗体滴度分别为160和40；猪血清标本抗 SC093和SC233病毒中和抗体滴度为80-320、20-80。

3讨论

1987 年，版纳病毒首次从中国云南西双版纳的脑炎患者中分离到[6]。随后在当地不明原因发热患者和脑炎患者血清标本、蚊虫、猪和牛标本内分离到数十株版纳病毒[6,7]。近年来在我国多个省区以及在越南、印度尼西亚等东南亚国家蚊虫中也多次分离到该类病毒[8,9]。本研究从师宗库蠓中分离到2株仅在C6/36细胞上产生明显细胞病变的病毒，通过进一步的分子生物鉴定，获得3个基因片段6条序列，这些片段序列均与版纳病毒中国分离株同源性最高达到99%，遗传进化结果也显示本次新分离的2株病毒与版纳病毒处于同一个进化分支，表明它们亲缘关系较为密切，提示云南师宗县2株新分离病毒SC093和SC233为版纳病毒，这是首次从云南省库蠓中分离到版纳病毒，库蠓究竟是偶然感染版纳病毒还是可作为版纳病毒的传播媒介，尚需进一步研究。2株病毒是通过随机引物扩增克隆鉴定为版纳病毒，对该病毒的进一步研究需要设计其特异性引物，说明分节段版纳病毒的带型,扩增全基因序列等等。库蠓样品的鉴定过程主要是通过形态学的方法进行，对样品的采集及保存就需要较高的要求，下一步需要寻求更有效可靠的方法进行种属鉴定。

版纳病毒为东南亚十二节段RNA病毒属(Seadomavirus)的病毒，该属病毒目前包括三种病毒，版纳病毒(Banna virus，BAV)、Kadipiro病毒(KDV)和辽宁病毒(Liaoning virus，LNV)，其PAGE 电泳带型为12 条带，具有12 条带的病毒还有在欧洲和美洲科罗拉多蜱媒热病毒(Colorado Tick Fever Virus，CTFV)，该病毒能引起人类严重脑炎[10]。版纳病毒是该属病毒中惟一一种从人的血清标本中分离并与人的发热和脑炎有关的病毒，感染BAV的患者显示出流感样症状，疲乏、关节痛、发热，严重者可引起脑炎[11,12]。本次从云南省师宗县库蠓中分离到版纳病毒，该病毒能引起鸡胚全身性出血，提示两株新分离版纳病毒对鸡胚有致病性。同时在当地采集牛血清和猪血清中存在版纳病毒中和抗体，抗体滴度高达1:320，提示在当地牛和猪等家畜动物中存在着版纳病毒感染的状况，约454组库蠓样品中仅分离到2株版纳病毒，分离率为0.44%，猪、牛血清版纳病毒抗体阳性率分别为1.7%、0.5%，提示二者之间存在感染相关性，而版纳病毒是否是引起当地家畜不明原因动物疾病的病原体，还需要对其致病性、流行病学等方面进行更深入的调查研究[13，14]。

4参考文献

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通信作者：李华春，Email: li_huachun@hotmail.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.02546450.2016.01.001

基金项目：重要牛羊虫媒病毒病防控关键技术研究与应用(201303035);云南省应用基础研究计划项目青年基金(2015FD064)

(收稿日期：2015-06-02)

First isolation and identification of Banna virus fromCulicoidespools in Yunnan

KouMeiling，ZhuJianbo，YangHeng，XiaoLei，WangJinping，MiaoHaisheng，WangJinglin，LiHuachun

YunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,YunnanTropicalandSubtropicalAnimalVirusDiseaseLaboratory,Kunming650224,ChinaCorrespondingauthor:LiHuachun,Email:li_huachun@hotmail.com

【Abstract】ObjectiveTo understand the virus-carrying status and infection condition of Culicoides in Yunnan province. MethodsCulicoides, cattle serum samples and pig serum samples were collected in Qujing City in Yunnan province from Sep. to Nov. in 2011; the supernatant of Culicoides was inoculated in C6/36 cells to isolate virus. Suspected isolates were identified by molecular biology techniques and titers of virus antibodies in pigs and cattles serum samples were tested by VN. Results8 300 short tarsal Culicoides(8 300/18 160) and 7 100 Ryukyu Culicoides (7 100/18 160) were identified among 18 160 Culicoides specimens. Two suspected virus strains were isolated and designated as SC093 and SC233. The nucleotide sequence homology of VP2, VP4 and VP8 sequences with Banna virus Chinese strain (Accession number: AF134526) is up to 99%. 1 out of 200(1/200) cattle serum samples was antibody positive against Banna virus with 0.5% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive cattle serum were 160 and 40.10 out of 535(10/535) pig serum samples were antibody positive against Banna virus with 1.7% positive rate. And the neutralizing antibody titers of SC093 and SC233 with above Banna virus antibody positive pig serum samples were 80-320 and 20-80 respectively. ConclusionsThe SC093 and SC233 virus strains isolated from Shizong were identified to be Banna virus and it could cause infection in pigs and cattles. This is the first report that Banna virus was isolated from Culicoides.

【Key words】Culicoides; Banna virus; Isolation; Identification